细胞内pH的微弱变化可以调节诸多细胞行为，例如细胞体积的调节、囊泡运输、细胞代谢、细胞信号传导以及细胞生长、增殖和凋亡等. 同时pH的变化也是监测癌症的手段之一，可以通过观察生物膜pH的变化来监测，其pH始终低于正常细胞. pH在众多细胞事件中具有核心作用，对炎症、癌症等疾病中异常细胞的生长和分裂具有重要影响^[1-3]，开发能够实时、原位检测pH的方法已引起越来越多的关注. pH检测方法主要包括紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、核磁共振和电化学法等，其中，荧光光谱法由于其操作简便、可实时和高灵敏度检测等优点而受到广泛关注. 荧光光谱方法需要提供具有荧光性能的物质作为检测对象，因此pH荧光探针方法近些年得了快速发展, 荧光探针方法最大的优点在于可以在不损坏细胞的情况下实时原位地监测细胞内pH的动态分布^[4-10].

典型的荧光探针包括识别基团和荧光基团，当识别基团接收到pH信号时，它将信号传递给荧光基团，引起其荧光性能的变化. 近年来, 越来越多的荧光发光基团被应用于荧光探针中，主要有香豆素类、荧光素类、花菁类、氟硼二吡咯染料(BODIPY)、罗丹明类以及双光子类等物质. 它们各有独特的优点，同时也存在一些缺陷, 例如：荧光素是一种常用的pH探针, 但是在细胞中容易渗出; 花菁类具备很好的近红外效应, 但易被光漂白；氟硼二吡咯染料类探针的光物理性质较为稳定，但在溶液中的溶解性较差；双光子pH探针特点鲜明, 同时对实验条件和实验设备的要求也明显高于其它探针^[11-14]. 本文选择苯并呋咱作为荧光基团，考察其衍生物作为pH荧光探针的识别性能. 苯并呋咱是重要的医药中间体，本文选择其衍生物4-氯-7-硝基苯并呋咱(NBD-Cl)作为初始原料，它是一种含活性卤素及芳香环硝基的荧光衍生试剂，反应活性高、反应速率快，能够保证荧光探针合成过程的简单易行^[11]. 此外，本文选择氨基、亚氨基作为识别基团，它们具有质子化和去质子化能力，研究苯并呋咱胺类衍生物的pH荧光探针性能.

1.   实验部分

1.1   主要试剂与仪器

试剂：4-氯-7-硝基苯并呋咱、二甲基亚砜、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、二乙醇胺、乙醇胺、氨水等试剂均为分析纯，市售. 溶液配制用水均为去离子水.

仪器：荧光光谱仪(FL-2500，日本日立，采用的激发波长均为465 nm)、紫外-可见分光光谱仪(UV-2700，日本岛津，光路狭缝为21 nm、扫描波长范围250~700 nm)、质谱仪(LCQ Deca XP MAX液相色谱-质谱联用仪，美国热电集团菲尼根，阴离子测试、质量数显示范围0~775)、核磁共振波谱仪(Varian 400 MHz，美国瓦里安)、pH计(雷磁PHS-3B酸度计, 上海精密).

1.2   探针的合成与表征

图 1为化合物NBD-N、NBD-NH和NBD-NH₂的合成路线，分别称取0.203 g(1.0 mmol)NBD-Cl溶于3个装有二氯甲烷(20.0 mL)的圆底烧瓶中，分别向其中滴加溶有2.0 mL二乙醇胺和2.0 mL乙醇胺以及4.0 mL含氨水(体积分数30%)的二氯甲烷溶液，在氮气氛围、室温下反应2 h.

图  1  化合物NBD-N、NBD-NH和NBD-NH₂的合成线路图

Figure  1.  The synthetic route for compound NBD-N, NBD-NH and NBD-NH₂

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反应结束后，采用真空旋转蒸发法去除溶剂，得到粗产物，最后用石油醚与乙酸乙酯(体积比1 ∶ 1)混合液作为洗脱剂进行层析分离. 分离后分别得到红色粉末状产物NBD-N(0.178 g，产率为62.03%)、红棕色粉末状产物NBD-NH(0.153 g，产率为62.17%)、绿色粉末状产物NBD-NH₂(0.107 g，产率为60.03%).

NBD-N的核磁共振数据(400 MHz, DMSO-d₆): 8.48(d, 1H)、6.53(d，1H)、5.02(m，4H)、4.25(m，2H)、3.75(m，4H). NBD-NH的核磁共振数据(400 MHz, DMSO-d₆): 9.42(d, 1H)、8.48(s, 1H)、6.53(d, 1H)、5.02(m, 1H)、3.75(m，2H)、3.51(m，2H)、NBD-NH₂的核磁共振数据(400 MHz, DMSO-d₆): 9.42(d, 1H)、8.48(s, 1H)、6.53(d, 1H)、5.02(m, 1H)、3.75(m，2H)、3.51(m，2H). 上述数据中，s表示单峰，d表示二重峰，t代表三重峰，m代表多重峰，“H”前面的数字代表氢质子的个数. 对3种探针分子依次进行质谱分析(甲醇作为溶剂). NBD-N分子式C₁₀H₁₂N₄O₅，相对分子质量理论值为268.08，实验值为267.29(去质子化峰). NBD-NH分子式C₈H₈N₄O₄，相对分子质量理论值为224.05，实验值为223.24(去质子化峰). NBD-NH₂分子式C₆H₄N₄O₃，相对分子质量理论值为180.12，实验值为179.11(去质子化峰).

1.3   溶液的配制

将3种探针分子(NBD-N、NBD-NH、NBD-NH₂)分别溶于二甲基亚砜中配成储备液(5.0 mmol/L).分别配备5.0 mmol/L的CuCl₂、MgCl₂、HgCl₂、CoCl₂、CaCl₂、Ni(NO₃)₂、Cr(NO₃)₃、AlCl₃、ZnCl₂、KCl、FeCl₃、AgNO₃、MnCl₂的水溶液. 用对应的NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、HAc/NaAc、H₂BO₃/Na₂B₄O₇和Na₂CO₃/NaHCO₃配成浓度为3.0 mmol/L不同pH(1.0~12.0)的缓冲溶液.

2.   结果与讨论

2.1   不同pH下探针的紫外-可见吸收光谱

不同pH条件下3种化合物的紫外-可见吸收光谱如图 2所示. 当溶液pH接近中性时，3种化合物的紫外-可见吸收光谱均显示出在波长350 nm和465 nm两处苯并呋咱的特征吸收峰. 随着溶液pH逐渐从7.0升高至12.0，NBD-N在波长350 nm处的吸收强度有微弱的上升，而波长465 nm处的吸收强度随着pH的增加逐渐减弱并发生蓝移. 这种蓝移主要由于苯并呋咱的特殊结构(苯环上1个硝基、2个碳氮双键强拉电子基团)使得苯环上另外2个碳原子带有部分的正电荷，当溶液pH增加时，容易受到带负电荷的羟基进攻，从而降低了NBD-N分子的推-拉电子效应，最终发生蓝移. 对于NBD-NH，当pH从7.0升至9.0，在波长476 nm处的峰值逐渐减弱，并蓝移至465 nm处；当pH从9.0升至12.0，465 nm处的峰值微弱增强. 这可能由于NBD-NH分子中的亚胺基与羟基发生作用，形成去质子化，从而减弱了亚胺基的供电子效应. 而当pH从7.0升高至12.0，NBD-NH₂在波长343 nm处的峰值逐渐增强，并红移至357 nm，处于465 nm处峰值随着pH的增加而增强. 由于在碱性条件下氨基的去质子化使氮原子的电子云密度增加，从而引起波长465 nm处吸收峰强度的增强. 从以上结果可以看出，这3种化合物分子结构的不同导致了它们对pH的响应有所不同.

图  2  3种荧光探针(10.0 μmol/L)在不同pH水溶液中的紫外-可见吸收光谱

Figure  2.  The absorption spectra of fluorescent probes (10.0 μmol/L) with different pH values

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2.2   碱性条件下的pH识别

在不同pH的缓冲溶液(3.0 mmol/L)中，3种化合物(NBD-N、NBD-NH、NBD-NH₂)的荧光发射光谱在波长550 nm处有1个强的荧光发射峰(图 3). 当pH由7.0升至12.0时，3种化合物的荧光光谱发生了不同程度的猝灭，NBD-N、NBD-NH、NBD-NH₂的荧光强度猝灭率分别为76.3%、99.3%、87.5%. 根据方程^[15]

图  3  3种荧光探针在不同pH缓冲溶液中的荧光发射光谱

注：探针溶液、缓冲溶液浓度均为10.0 μmol/L，激发波长为465 nm.

Figure  3.  The fluorescence spectra of three fluorescent probes in buffer solution with various pH values

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可以计算NBD-N、NBD-NH、NBD-NH₂的pK_a分别为8.86、8.66、8.94. 结果表明：3种化合物在pH为7.0~12.0的范围内可以灵敏地检测水溶液的pH，可适用于碱性环境下pH检测的荧光探针^[16]；由于3个分子结构的类似性，使其对pH的识别响应机理类似，而分子结构的细微差别使其表现为荧光强度I的不同变化量和不同pK_a. 在基础实验中，当pH由7.0降至1.0时，3种探针分子(NBD-N、NBD-NH和NBD-NH₂)的荧光强度I几乎没有变化，说明3种探针分子在酸性条件下对pH的变化无响应，因此，本文不讨论酸性条件的pH响应. 由图 4可知，3种探针分子在碱性条件下均具有较好的检测能力.

图  4  3种荧光探针的荧光发射峰强度与pH的关系

Figure  4.  The intensity of the fluorescence emission peak of three fluorescent probes with different pH values

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2.3   pH识别的可逆性及金属离子干扰性

当溶液的pH由7.0增加到12.0，NBD-N、NBD-NH和NBD-NH₂的荧光光谱(图 3)显示：3种荧光探针发生明显的荧光识别作用，而当分别向溶液中加入100.0 mmol/L HCl将pH调回至初始pH时，这3种荧光探针的荧光发射强度完全恢复，说明这3荧光探针具有很好的识别可逆性，并具备可循环利用性能.

荧光探针的抗干扰能力是荧光识别的重要评价指标，3种pH荧光探针对常见金属离子的抗干扰实验结果如图 5所示. 在pH为7.0的条件下, 分别向NBD-N、NBD-NH和NBD-NH₂这3种探针的缓冲溶液中加入100.0 μmol/L Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Al³⁺、Ca²⁺和Mg²⁺，发现3种探针的荧光强度几乎不发生变化，说明3种探针分子具有很好的抗干扰能力，具有实际应用潜力.

图  5  3种荧光探针在不同离子缓冲溶液中的荧光发射光谱

注：向pH为7.0的缓冲溶液中分别加入100.0 μmol/L的Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Al³⁺、Ca²⁺和Mg²⁺.

Figure  5.  The fluorescence spectra of three fluorescent probes in buffer solution with different ions

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2.4   通过核磁共振谱对pH识别机理的研究

为了探究3种荧光探针在碱性条件下的识别机理，测试了NBD-N和NBD-NH的核磁共振图谱，分析3种荧光探针对OH^-的识别机理(图 6). 当向探针NBD-N溶液中加入OH^-后，NBD-N的4个氢质子的化学位移变化非常明显(图 6A)，并且每一种氢质子均分裂成2组不同化学位移的峰：H(1)的化学位移δ=-0.11、-1.27；H(2)的化学位移δ=-0.62、-0.48；H(3)的化学位移δ=-0.37、-0.82；H(4)的化学位移δ=-0.41、-0.77. 这是由于硝基和碳氮双键具有强拉电子效应，使与H(1)和H(2)相连的2个C原子带有部分的正电性. 由此提出NBD-N对OH^-的识别机理(图 6B)：在碱性条件下，2个C原子与溶液中的OH^-相互作用^[17-18]，并产生2种互为同分异构体的过渡结构；与此同时，由于OH^-带负电荷，当OH^-与NBD-N结合时，整个NBD-N分子的电子云密度均表现出不同程度的增加，引起氢质子1至4均向高场方向移动并分裂成2个不同位移的峰，进而改变了NBD-N的紫外吸收性能. 当探针分子NBD-NH处于碱性条件时，氢质子H(1)、H(2)、H(4)和H(5)发生明显的化学位移(图 6C)，H(1)和H(2)分别向高场移动，而H(4)和H(5)则向低场移动，同时H(1)和H(2)分裂成2组峰. H(1)的化学位移δ=-0.83、-0.93，H(2)的化学位移δ=-0.23、-0.34，H(4)的化学位移δ=0.19，而H(5)的化学位移δ=0.22. 由此提出NBD-N对OH^-的识别机理(图 6D)：一方面，由于苯环上的亚氨基能够在碱性条件发生去质子化，使共轭体系电子云密度增大，造成苯环上的H(1)和H(2)在高场方向有较大的化学位移；另一方面，由于亚氨基的去质子化作用使氮原子有一对裸露的孤对电子，容易与NBD-NH中的羟基形成氢键，五元环的稳定结构也能促使氢键的形成. 因此，H(4)和H(5)在低场方向有较大的化学位移. 探针NBD-NH₂与探针NBD-NH具有类似结构且氨基更活泼、更易发生去质子化作用，故NBD-NH₂识别OH^-的机理与NBD-NH的相似.

图  6  2种探针在碱性条件下的核磁共振谱及其对OH^-的识别机理示意图

Figure  6.  The NMR spectra of two probes under alkaline condition and their recognition mechanism for OH^-

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3.   结论

合成了3种结构新颖的可识别碱性环境的pH荧光探针——NBD-N、NBD-NH和NBD-NH₂，通过核磁共振谱与质谱对其结构进行了表征. 当水溶液的pH由7.0增大至12.0时，3种荧光探针的荧光发射峰发生不同程度的猝灭，对碱性环境表现出优异的荧光识别特性，与同类有机小分子荧光探针相比，3种荧光探针对碱性环境具有良好的选择性、灵敏性、抗干扰能力以及可逆性，具有潜在的应用价值.同时，3种探针属于苯并呋咱类pH荧光探针，这对于pH荧光探针分子的设计、苯并呋咱类荧光探针的开发具有一定的参考价值和研究意义.