卵巢衰老是指雌性动物在身体衰老前所发生的卵巢功能主动丧失的生理过程，包括生理性和病理性两种，它是一种功能获得性突变, 引起生殖功能的下降直至衰退^[1]。卵巢衰老主要表现为卵子数量下降和卵子质量下降^[2]。在卵泡发育初期，生殖轴相关基因协同促进卵泡的发育，维持卵母细胞的质量和数量都在一定的范围内，卵母细胞和颗粒细胞之间通过胞间相互作用共同促进卵子发育^[3]。随着年龄的增长，卵泡数量急剧下降，同时体内代谢物堆积可导致卵巢微环境的改变，如氧自由基造成卵泡DNA损伤，最终导致卵泡闭锁或凋亡^[4]。因此，卵泡数目不断衰减，且无新生卵子补充，是导致卵巢衰老的重要的直接原因。卵子质量下降可以表现在表观遗传学变化、线粒体功能异常、核DNA突变、端粒变短等，其主要原因可能是氧化应激(ROS)在卵巢组织中的堆积^[4]。ROS在生殖过程中具有重要作用，例如在排卵期间，随着促黄体生成素(LH)激增和卵泡内新生血管化的形成，血管内皮细胞和巨噬细胞会产生大量的ROS，由此为卵母细胞成熟和卵泡破裂提供所需的刺激^[5]。如果ROS浓度与抗氧化能力发生不平衡，卵母细胞和颗粒细胞容易因氧化应激而受损，导致卵母细胞质量下降^[6]。

姜黄素(curcumin)是一种具有生物活性的多酚类化合物，从姜黄根茎中提取，是一种淡黄色化合物，在亚洲被广泛用作食品添加剂、膳食香料和草药^[7]。有研究表明，姜黄素具有较强的生物活性，包括抗炎、抗菌和抗氧化等^[8]；姜黄素及其代谢物在一定程度上能延长一些模式生物(如秀丽隐杆线虫、黑腹果虫、酵母和小鼠)的平均寿命^[9]；姜黄素的抗氧化功能可以减少自由基对细胞的损伤^[10]、可以减少由炎症引起的组织损伤^[11]、可以保护神经细胞免受氧化应激和炎症的损害^[12]等，从而帮助延缓衰老进程。姜黄素还被发现具有一些其他可能有助于延缓衰老的作用，如促进细胞再生、调节基因表达等^[13]。但姜黄素对于卵巢衰老的研究报道不多。有研究发现，姜黄素可以通过调节卵巢组织中的氧化应激和抗氧化系统，减少氧化损伤，从而延缓卵巢衰老的过程^[14]；姜黄素可能通过调节相关基因改善小鼠的卵巢质量，增强卵母细胞成熟和胚胎发育^[15]。由此可见，姜黄素在卵巢衰老方面也可能起一定的积极作用，但仍需深入研究。

为了进一步探讨姜黄素在调控卵巢衰老过程中的作用，本研究选取了一种表现为卵巢提早衰老的斑马鱼突变体为研究对象。通过一段时间的药物喂食后，检测斑马鱼的产卵功能、调控生殖的相关基因表达水平等，从而探讨姜黄素是否对斑马鱼的卵巢衰老有延缓作用及其可能的作用机制，以寻找姜黄素能有效缓解机体生殖衰老的证据，为水产养殖生产上延长鱼类的生殖周期、提高产量提供更多的参考。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

本实验所使用药品试剂采购自北京索莱宝科技有限公司、北京艾德莱生物科技有限公司和上海阿拉丁生化科技股份有限公司等；所使用的动物均为表现为卵巢提早衰老的斑马鱼突变体(简称突变体)，该突变体的卵巢产卵功能约在250~300天龄基本丧失，而正常野生型斑马鱼的卵巢产卵功能可持续到2~3年龄。动物饲养在斑马鱼养殖系统(上海海圣)，光照周期为10 h灯光、14 h黑夜，每天喂食2次。

1.2   药物处理及采样

本实验的药物处理方法采用了喂食法。为选择合适的药物处理浓度，首先参考了文献[9]所报道的实验浓度，设置了4、8、16 mM和15、20、25 mM两组系列浓度梯度开展预实验。在为期20天的预实验中，浓度为15 mM以上的处理组陆续有鱼死亡，而浓度为25 mM的处理组在预实验结束时基本死亡。因此，本实验选择了4 mM和8 mM为正式实验浓度。具体操作如下：以无水乙醇作为助溶剂，配置浓度分别为4 mM和8 mM的溶液；然后分别混入等量的饲料中，并将配好的饲料放置在常温条件下的通风柜中自然吹干；最后装入容器，于4 ℃冰箱保存待用。

选取250日龄的斑马鱼突变体45条，随机分配每组15条，共3组，分别是对照组、4 mM药物处理组和8 mM药物处理组。其中，对照组采用无添加药物的无水乙醇混入等量饲料中进行喂食；4 mM药物处理组和8 mM药物处理组则每天分别投喂上述混合好的饲料2次，每次投喂量约为鱼体重的5%，持续28天。实验处理结束后，解剖并分别收集大脑、垂体、卵巢组织，然后保存于TRIpure溶液中，用于后续mRNA的提取；其中留取一部分卵巢进行组织学检测分析。

1.3   产卵功能检测

从药物处理开始后，每隔3天进行一次产卵测试，每组随机选取2条鱼，与野生型雄鱼按照雌雄比为1∶2进行产卵测试，然后计算产卵总量及其卵子存活率，评估药物对斑马鱼的排卵数量、卵子质量的影响。

1.4   卵巢的组织学观察

药物处理结束后，采集一部分卵巢组织用于组织学观察。采集到卵巢组织后，用Bouin's液固定3天，然后进行脱水、包埋、切片；通过苏木精-伊红染色后进行观察、拍照记录。卵母细胞的发育时期的统计采用ImageJ软件进行分析和计算。

1.5   RNA的提取及RT-PCR

大脑、垂体、卵巢的RNA提取按照TRIpure Reagent生产厂家(北京艾德莱生物科技有限公司)提供的产品使用说明进行。具体步骤简要描述如下：(1)加入50 μL氯仿，充分混匀后静置5 min，然后于4 ℃下12 000转/min离心15 min。(2)吸取上清，然后加入异丙醇，充分混匀后于-20 ℃下静置30 min，然后于4 ℃下12 000转/min离心20 min。(3)离心结束后，弃上清液，加入75%乙醇溶液进行洗涤沉淀，7 500转/min离心5 min，弃上清液；重复此步骤，充分洗涤RNA。(4)RNA干燥后，加入无菌去离子水溶解RNA。采用北京艾德莱生物科技有限公司提供的试剂(TUREscript H M-MLV Reverse Transcriptase)和附带的产品使用方法建立dDNA文库。基因表达的检测采用半定量PCR的方法，所使用到的基因引物见表 1。

表  1  基因引物序列

Table  1.  Genes primer sequences

基因名称	引物序列	产物长度/bp
ef1a	上游GGCTGACTGTGCTGTGCTGATTG	409
	下游CTTGTCGGTGGGACGGCTAGG
gdf9	上游GAGTCTGTTGAACCCGACGT	203
	下游GCGGTGTTGTACAGGTGAGA
arom	上游AGAGAACGTCAGGCAGTGTG	489
	下游GACAGCAGAGCCACCAGAAT
gnrh2	上游CCGCTCACTTCAGGAAAAAG	394
	下游GAAGCATCAGCTTGGTGTCA
gnrh3	上游TGGAGTGGAAAGGAAGGTTG	351
	下游GGAGTCCAAAAACATGCTCTC
kiss1	上游GCAATATGAATACCAGGGCG	355
	下游TAAAGCATCATTGGCAGCAG
kiss2	上游ATTGATGTTGTCAGTGGCGA	307
	下游CAATCGTGTGAGCATGTCCT
fshb	上游TTGTTCTGGCGCTGCTGTTGC	199
	下游TTCTGGGTGTGCTGTGCCAT
lhb	上游GGTGTCTTCTTTCTCTTCTC	186
	下游CGGGCTCTTGTAAACGGGAT
gh	上游TTCAACAACGCATGCATCCG	319
	下游TCAGGTCCGCCAGTTTCTCA

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1.6   数据统计与分析

所有数据使用GraphPad Prism 8进行分析和作图。本实验的统计结果均以“平均值±标准差”表示，P < 0.05表示差异有统计学意义。所有实验均重复3次以上。

2.   结果与分析

2.1   姜黄素对衰老卵巢的产卵功能的影响

用姜黄素连续处理雌性斑马鱼28天，以检测姜黄素是否对衰老卵巢具有促进作用。在此期间，每隔3天进行一次产卵测试，持续到药物处理结束。由检测结果(图 1A)可知姜黄素在一定浓度下能维持卵巢的功能：从产卵的数量上看，3个组别的斑马鱼突变体的产卵量均呈下降趋势；与对照组相比，4 mM药物处理组产卵量的下降趋势较为缓慢，而8 mM药物处理组的产卵量维持在刚开始药物处理时的水平，没有随着时间的推进而下降。

图  1  姜黄素对衰老卵巢功能的影响

Figure  1.  Effects of curcumin on the reproductive ability of zebrafish

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另一方面，通过统计每次产出的胚胎的受精率和存活率来检测卵母细胞的质量。由统计结果(图 1B、C)可知：对照组和4 mM药物处理组的胚胎的受精率和存活率较为相似，虽然均存在一定的波动，但总体上随着年龄增长呈现下降趋势，最后趋向于0；8 mM药物处理组的胚胎的受精率从第3次测试开始均高于对照组和4 mM药物处理组，而且到检测结束时受精率仍有约50%；8 mM药物处理组的胚胎的存活率也均高于对照组和4 mM药物处理组，而且在检测结束时仍维持在约30%水平。由此可知，8 mM药物处理组的产卵量和卵母细胞的质量都明显高于对照组、4 mM药物处理组，说明适当浓度的姜黄素在延缓卵巢衰老中可能具有一定的积极作用。

2.2   姜黄素对衰老卵巢的健康状态的影响

从产卵功能的测试结果看，姜黄素在一定程度上改善了衰老卵巢的产卵功能。为了分析姜黄素改善产卵功能的原因，首先对药物处理后的斑马鱼卵巢进行了组织学的观察比较。由图 2可知：对照组和4 mM药物处理组的卵巢组织中出现了明显的纤维化组织，而在8 mM药物处理组中几乎没有发现纤维化组织；对照组的卵巢中已经几乎没有处于发育后期的卵母细胞，仅存在较多的发育前期的卵母细胞；在4 mM药物处理组中的卵巢组织，虽然还有一些发育后期的卵母细胞，但部分卵母细胞已趋向不健康状态；在8 mM药物处理组中，各发育时期的卵母细胞都存在，且均处于健康状态。

图  2  姜黄素对斑马鱼卵母细胞发育的影响

Figure  2.  Effects of curcumin on the oocyte of zebrafish

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然后，通过统计分析对照组、4 mM药物处理组和8 mM药物处理组中不同发育时期的卵母细胞的数量来检测姜黄素对卵巢的影响。由图 3可知：虽然对照组中处于卵黄前期、早期的卵母细胞数量比4 mM、8 mM药物处理组的多，但对照组中处于卵黄后期、成熟期的卵母细胞数量比4 mM、8 mM药物处理组的少，虽然这些结果没有体现出显著性差异。

图  3  姜黄素对卵巢中各发育时期的卵母细胞的影响

PG：初级生长阶段，PV：卵黄前期，EV：卵黄早期，MV：卵黄中期，LV: 卵黄后期，FG：成熟期

Figure  3.  Effect of curcumin on the number of different developmental stage oocytes

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2.3   姜黄素对斑马鱼生殖轴相关基因表达的影响

2.3.1   姜黄素对下丘脑kiss1、kiss2、gnrh2、gnrh3的表达影响

为进一步探讨姜黄素改善卵巢功能的原因，从生殖轴的上游——下丘脑开始，检测其调控促性腺激素分泌的相关基因。对kiss1、kiss2的表达分析结果(图 4A、B)表明：姜黄素对kiss1的表达有一定的促进作用，但对kiss2的表达几乎没有影响，仅在8 mM药物处理组呈现轻微的上升趋势。对促性腺激素释放激素gnrh2和gnrh3的表达检测结果(图 4C、D)表明：姜黄素对这2个基因的表达都有一定的促进作用，其中8 mM药物处理显著上调了gnrh3的表达。

图  4  姜黄素对kiss1、kiss2、gnrh2和gnrh3的表达影响

Figure  4.  Effects of curcumin on the expression of kiss1, kiss2, gnrh2, and gnrh3 in zebrafish

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2.3.2   姜黄素对脑垂体fshb、lhb和gh表达的影响

除了对下丘脑的相关基因进行检测外，还对脑垂体中直接调控卵巢发育的相关基因进行分析。结果显示：姜黄素对促卵泡生长激素fshb和促黄体生成激素lhb的表达都有抑制趋势，但没有显著性差异(图 5A，B)；对生长激素gh的表达，不管是4 mM药物处理组还是8 mM药物处理组，都呈现明显的抑制作用(图 5C)。

图  5  姜黄素对fshb、lhb和gh的表达影响

注：*、**分别表示P < 0.05、P < 0.01。

Figure  5.  Effects of curcumin on the expression of fshb, lhb, and gh in zebrafish

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2.3.3   姜黄素对卵巢gdf9和arom表达的影响

在卵巢发育中，gdf9和arom是重要的调控因子。为了进一步分析姜黄素改善卵巢功能的原因，对这2个基因进行了表达检测。结果(图 6)显示：姜黄素对gdf9的表达没有影响，而对arom的表达有一定的抑制作用趋势，在8 mM药物处理组的表现尤为明显。

图  6  姜黄素对gdf9和arom的表达影响

Figure  6.  Effects of curcumin on the expression of gdf9 and arom in zebrafish

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3.   讨论

卵巢衰老作为衰老话题的一个分支，一直是研究的热点之一。早在1964年，就有学者探讨雌性生殖衰老问题^[16]。到目前为止，学者们对生殖衰老进行了大量研究，对卵巢衰老的机制有了初步的解析，其中被广泛接受的是氧化应激理论^[17]。当体内的活性氧失衡时产生氧化应激反应，造成卵巢的损伤，从而加速卵巢衰老^[18]。在药物延缓衰老方面也有大量的研究，其中姜黄素由于其特有的抗炎、抗癌、抗衰老等特性而受到广泛的关注^{[8, 19-20]}，但目前关于姜黄素针对卵巢衰老方面的研究报道仍较少。已有研究^{[15, 21]}初步证明姜黄素能在一定程度上缓解或推迟小鼠的卵巢衰老现象。本文利用斑马鱼作为研究对象，进一步探讨了姜黄素对卵巢衰老的作用。

本文的实验结果显示，经姜黄素处理后的年老雌鱼，其产卵的数量以及胚胎质量都有一定程度的提高，这说明姜黄素确实改善了衰老卵巢的健康状态。但是在产卵测试中，胚胎的受精率和存活率有一定幅度的波动，这可能与当时的天气变化有关。通过对卵巢的组织学观察，本文发现姜黄素的处理对斑马鱼卵巢有积极的促进作用，减少了卵母细胞坏死的数量。这一结果与关于小鼠的研究结果^[15]基本一致。卵巢的发育受体内的生殖轴(下丘脑-垂体-卵巢)相关的信号调控完成，为进一步解析姜黄素通过哪种途径影响卵巢的功能，本文挑选了部分卵母细胞的调控因子进行分析。Kisspeptin作为GnRH的上游调控因子，能促进GnRH的产生，并由此调控FSH和LH的产生和分泌^[22]，而卵巢的发育和排卵则分别依赖于FSH和LH的调节^[23]。本文的结果显示，姜黄素对斑马鱼的kiss1、kiss2、gnrh2、gnrh3的表达都有一定的促进作用，其中gnrh3在8 mM药物处理下的表达有显著上升。有报道^[24]指出GnRH的升高有助于延缓衰老，本文的结果与此报道一致。然而，本实验结果显示姜黄素对fshb和lhb的表达水平几乎没有产生影响，这可能预示着FSH和LH对卵巢的衰老没有明显的直接作用。到目前为止，FSH、LH与卵巢衰老的关系仍没有完全研究清楚。另一方面，姜黄素对垂体中gh的表达有显著的抑制作用。有报道^[25]指出减少GH可能延缓机体衰老，本文的结果也与此报道相吻合。

另一方面，卵巢中的相关因子也可能与其自身的衰老有关。有报道^[26]指出，gdf9表达水平的降低或缺失都将导致卵泡发育停止，初级卵泡的储备大大降低，使卵巢走向衰老。然而，本实验中并未检测到gdf9表达水平的变化，这可能提示姜黄素改善衰老卵巢的产卵功能不是通过提高初级卵泡的数量来完成，这一结果也与其相应的卵巢组织学分析结果一致。体内雌激素通常随着卵巢衰老而下降^[27]，作为调控雌激素表达的基因arom也可能随着卵巢衰老而下降。但本实验没有观察到姜黄素对arom表达的促进作用，反而呈现抑制作用。这提示姜黄素提高衰老卵巢的卵母细胞的质量可能通过其他途径实现，其具体机制有待进一步研究。此外，amh在卵母细胞早期发育中起重要作用，在临床检查上通常作为衡量卵巢健康状态的指标^[28]。当卵巢功能衰退后，amh的表达几乎不可检测^[29]。本实验也检测了amh的表达水平，但是不管在对照组还是药物处理组，都几乎没有检测到amh的表达。经分析，导致我们无法比较分析amh的表达变化的原因可能是：amh在野生型斑马鱼卵巢中的表达水平本来就不高，远远低于其在精巢中的表达^[30]；本文使用的是卵巢衰老模型，可能更加降低了amh的表达水平。

4.   结论

本文利用斑马鱼为实验对象，采用喂食的药物处理方法，对成年斑马鱼持续处理姜黄素28天；通过对斑马鱼的产卵能力的检测、卵巢的组织学观察分析、检测生殖轴中相关基因的表达等手段，探讨姜黄素对卵巢衰老的作用影响。实验结果表明：(1)4 mM和8 mM浓度的姜黄素处理，在一定程度上有效地提高了衰老卵巢的产卵数量，其中8 mM药物处理组表现的效果最为显著。(2)8 mM药物处理组的卵母细胞的受精率和受精卵的存活率得到较为明显的提高，表明该浓度的姜黄素可在一定程度上改善卵巢的健康状态。(3)对卵巢组织学的检测表明，与对照组相比，8 mM药物处理组的卵巢处于较为健康的状态。(4)通过检测生殖轴中相关基因的表达，发现8 mM的姜黄素处理可提高gnrh3的表达，同时又抑制gh的表达, 因此推测姜黄素改善卵巢的健康状态的部分原因可能是通过调节下丘脑区的GnRH和脑垂体中的GH来完成。(5)卵巢中的arom基因的表达在4 mM和8 mM的药物处理组中都表现出下调趋势，而且随着浓度增加而增强，表明姜黄素也可能作用于卵巢组织，通过影响卵母细胞发育的相关调控因子来影响卵巢的健康状态。

本实验的研究结果丰富了姜黄素在抗卵巢衰老方面的作用机制研究, 但由于实验条件所限，实验还存在一些不足之处，后续可在药物浓度的设定、药物处理的时间、卵母细胞发育调控基因的表达检测等方面继续开展相关实验，从而进一步完善姜黄素抗卵巢衰老的功效及其作用机制的研究。