Repair Effect of the Total Alkaloid of Sophora Viciifolia on Achilles Tendon Injury in Rats
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摘要:
为探究白刺花提取的生物总碱(The total alkaloid of Sophora Viciifolia, SVA)对损伤肌腱的修复机制，采用SVA处理大鼠的损伤跟腱，利用跟腱功能指数(Achilles Functional Index，AFI)和组织学评分分析SVA对大鼠跟腱损伤修复的影响。结果表明：SVA显著增加了大鼠的AFI; 组织学评分显示SVA处理组肉芽组织、粘连和瘢痕的形成减少；苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining，H&E)染色结果显示SVA处理组的炎性细胞浸润减少；Masson染色证明SVA处理组比对照组含有更加丰富的胶原纤维；免疫荧光和分子对接等实验证实SVA可以抑制损伤跟腱炎症和血管新生标志因子的高表达，而且在损伤后第14 d加入SVA作用的效果优于在损伤后第7 d加入SVA的效果。研究证明了SVA可以通过调控炎症和血管新生信号通路来促进损伤跟腱的修复。
Abstract:To explore the repair mechanism of the total alkaloid of Sophora Viciifolia (SVA) on injured Achilles tendon, SVA was used to treat the injured Achilles tendon of rats. The effect of SVA on the repair of Achilles tendon injury was analysed by Achilles functional index (AFI) and histological evaluation score. The results showed that SVA treatment significantly increased AFI in rats, and histological observation score showed that the formation of granulation tissue, adhesion and scar were reduced in the SVA treatment group. Hematoxylin-eosin (H&E) staining showed that inflammatory cell infiltration was reduced in the SVA treatment group, and Masson staining proved that the SVA treatment group contained more collagen fibers than the control group, as well as immunofluorescence and molecular docking experiments confirmed that SVA could inhibit the high expression of inflammation and angiogenesis markers of injured Achilles tendon, and the effect of adding SVA on the 14th day after injury was better than that on the 7th day. It is demonstrated that SVA promotes the repair of injured tendons by regulating inflammation and angiogenesis signaling pathways.
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跟腱在人体运动中扮演着关键的角色，但由于其血液供应有限、代谢率低，一旦受损甚至断裂，其自我修复能力非常有限[1]。促进损伤肌腱修复、提高治疗质量并恢复其功能，仍然是临床上面临的重要挑战[2]。
血管新生在肌腱损伤的修复中发挥关键作用，适宜的血管新生可加速肌腱愈合，但过度的血管新生可导致肉芽组织、粘连和疤痕的形成，降低修复肌腱的强度，因此，抑制过度血管新生是肌腱损伤修复的关键。低氧诱导因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α，HIF-1α)及其靶基因血管内皮生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A，VEGFA)、血小板衍生生长因子B(Platelet-derived Growth Factor B，PDGFB)的高水平表达与显著恶化的预后相关。而本课题组前期研究[3]发现PDGFB比VEGFA在肌腱细胞的损伤修复中发挥更重要的作用，PDGFB是组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone Deaceylase Inhibitors，HDACIs)的作用靶点，HDACIs可通过调控p53-HIF-1α-PDGFB信号通路来抑制损伤肌腱的血管新生，促进肌腱损伤的修复。
尽管HDACIs类药物治疗肌腱损伤的作用比较明确，但也存在易产生耐药性、副作用较大的缺点[4]。白刺花(Sophora Viciifolia)为灌木或小乔木，高1~4 m; 枝多开展，小枝初被毛，旋即脱净，不育枝末端明显变成刺，有时分叉，羽状复叶；是贵州苗族重要的道地药材[5]。《贵州草药》记载其：“苦，清热，凉血，解毒。治鼻血，便血”。XU等[6]对白刺花的化学成分、质量标准、药理作用的研究现状进行了总结，认为白刺花主要含有的6种生物碱在白刺花种子中的质量分数最高，具有抗癌、抗炎、抗血管新生的作用，其中，以亲脂性的槐果碱在降低小鼠腹腔毛细血管通透性的作用最佳。虽然白刺花提取的生物碱(the total alkaloid of Sophora Viciifolia, SVA)的抗炎作用研究较多[7]，但较少从血管新生等角度研究治疗组织损伤的作用。有研究[2]表明跟腱损伤修复过程中伴随着异常的血管新生，而且课题组前期研究[3]从肌腱细胞水平上证明抑制血管新生相关因子的表达有利于损伤肌腱细胞的修复，但尚未在大鼠体内水平上证实。因此，本文尝试构建大鼠跟腱损伤模型，通过局部注射SVA后，从跟腱功能恢复、组织形态、炎症因子和血管新生因子的表达情况以及炎症、血管新生状况等方面考察白刺花提取物对损伤大鼠跟腱修复的作用，并利用分子对接预测SVA中主要的氧化槐果碱是否能与血管新生相关因子结合，以期能初步阐明SVA在大鼠体内促进跟腱损伤修复的机制。
1. 材料和方法
1.1 实验对象
SD大鼠(400±10 g)由陆军军医大学实验动物中心提供，所有动物实验均通过陆军军医大学伦理委员会批准(SYXK-2012-0003)。大鼠分笼培养，每笼4~5只，采用12 h循环光照，饲养温度为20~23 ℃，相对湿度为50%~70%。
1.2 白刺花种子总碱的提取
取白刺花种子适量，按料液比1∶4加入75%乙醇，浸渍提取3次，提取时间分别为7、15、24 h，每小时搅拌1次。合并上清液，再抽滤得到滤液。取滤液，减压浓缩至无醇味的稠膏状物体，即白刺花种子醇提物。取四分之一醇提物留样。剩余醇提物加1.8%的盐酸溶液400 mL，搅拌均匀，静置12 h，加入碳酸钠固体粉末碱化，调pH至9~10，密闭，放置过夜。将加入了碳酸钠的醇提物溶液抽滤，滤液每150 mL分为一份，每份萃取5次，每次10~20 min，取下层液合并，加无水硫酸钠除去多余水分。将干燥后的萃取液减压浓缩并回收氯仿至稠膏状，取出稠膏，于-20、-80 ℃冰箱分别保存1、4 h，再冷冻干燥48 h后得到棕黄色蜂窝状粘稠物质(即SVA)。
1.3 实验分组
将SVA溶解于二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)中，得到质量浓度为50 mg/mL的SVA溶液，12只大鼠被随机分为4组(每组3只)：
(1) 正常对照组：不做任何处理组；
(2) 损伤+DMSO 7 d组：大鼠跟腱损伤后第7 d, 将DMSO注射到跟腱损伤处的皮肤下；
(3) 损伤+SVA 7 d组：大鼠跟腱损伤后第7 d, 将0.1 mL质量浓度为50 mg/mL的SVA溶液注射到跟腱损伤处的皮肤下；
(4) 损伤+SVA 14 d组：大鼠跟腱损伤后第14 d, 将0.1 mL质量浓度为50 mg/mL的SVA溶液注射到跟腱损伤处的皮肤下。
1.4 大鼠跟腱损伤模型的构建
SD大鼠跟腱损伤模型通过手术切割缝合术构建，简要步骤如下：
(1) 腹腔注射麻醉剂2%戊巴比妥钠(剂量70 mg/kg)，静置10 min后，确定大鼠被麻醉；
(2) 用75%乙醇消毒跟腱处；
(3) 超净台内，使用手术刀切开后肢跟腱处皮肤，用镊子挑出跟腱；
(4) 用手术刀切断跟腱，然后使用持针器和带针缝合线缝合断裂的跟腱，最后缝合皮肤(图 1)；
(5) 放回笼中，正常饲养。
1.5 跟腱功能指数(Achilles Functional Index，AFI)测量
按改进后的Bunnel方法[2]测量SD大鼠的AFI，通过比较损伤侧与正常侧脚步的AFI进行跟腱的功能性分析。过程如下：
(1) 在损伤前1 d以及损伤后第1、7、14、21 d，在跑道中铺垫白纸；
(2) 在大鼠后掌上涂抹红色印油，让其迅速通过跑道；
(3) 从跑道上取回白纸，纸上的脚印拍照；
(4) 利用ImageJ软件测量实验后的SD大鼠中间脚趾宽度(Intermediate Toe，IT)、足趾宽度(Toe Spread，TS)和后肢手术侧(Experiment，E)、正常侧(Normal，N)的脚印长度(Footprint Length，FL)，如图 2；
(5) 分别计算每组实验SD大鼠的脚印长度系数(Footprint Length Factor，FLF)、脚趾宽度系数(Toe Spread Factor，TSF)以及中间脚趾宽度系数(Intermediate Toe Spread Factor，ITF)，计算公式如下：
FLF=(FLN−FLE)/FLE,TSF=(TSE−TSN)/TSN,ITF=(ITE−ITN)/ITN; (6) 根据文献[1]，通过多元线性回归分析确定每个参数对总体指数的相对贡献，并相应地对变量进行加权，计算每只SD大鼠损伤侧的AFI值：
AFI=74×FLF+161×TSF+48×ITF−5 。 1.6 组织形态观察
观察各实验组SD大鼠伤口状态，损伤后第21 d取材，并拍照，然后采用外观评分表(表 1)进行评分，分析修复肌腱组织的形态。
指标 得分 指标 得分 跛行 肿胀和发红的肌腱 左脚完全跛行 1 没有肿胀/不发红 2 左脚不完全跛行 0 可见肿胀，无发红 1 连接肌腱和皮肤/滑动 可触到的红肿 0 不是黏附的，滑动的 1 邻近的肌腱 黏附性，不能完全滑动 0 未改变的 1 肌腱破裂 改变(颜色、厚度和表面) 0 不存在 1 肌腱的形状 存在 0 正常的 3 炎症 略增厚 2 不存在 1 中等增厚 1 存在(水肿、肿胀和发红) 0 强烈的增厚 0 手术区域的肌腱表面 肌腱的颜色 完好无损，光滑 1 亮白色 1 不均匀的，粗糙的 0 半透明，暗白色，玫瑰色 0 肌腱/腱旁和筋膜，可滑动 肌腱的单应变 不附着的，可移动的 1 正常的结合 1 附着的，而不是滑动的 0 粘连，严重并生的 0 1.7 组织学评估
采用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining，H&E)和Masson's trichrome染色，在损伤后第21 d取材，新鲜的组织切成1 cm×1 cm×1 cm的组织块后，用OTC包埋，放入液氮罐中保存。使用的时候，用冷冻切片机切片成厚度为8 μm的切片，根据H&E和Masson's trichrome染色的说明书进行实验。
参考组织学评分表(表 2)对拍照后的图片进行单盲法评分。
指标 得分 肌腱的ECM组织 胶原纤维呈波浪形，紧密平行排列 2 部分紧凑，部分松散或无序 1 松散，不有序(肉芽组织) 0 细胞/胞外基质比例 生理的 2 局部细胞密度增加 1 细胞密度增加或ECM的质量分数减小 0 细胞排列 单轴的 2 超过10%的区域细胞排列不规则 1 超过50%的细胞没有单轴对齐 0 细胞分布 均匀的、生理的 1 细胞密度升高(细胞聚集) 0 细胞核形态 主要是伸长的异色细胞核(肌腱细胞) 2 超过10%的细胞具有多形性、卵圆形、异色、大或正色细胞核 1 主要是直径10 μm以上、卵圆形、着色或多形、异色细胞核 0 肌腱的修复组织 均匀的(组成相似的整个组织) 2 局部异质组织组成 1 整个组织成分完全改变 0 愈合组织的形态 正常的，只在手术区域，局部受限 1 强壮的，改变整个肌腱，组织增厚 0 退行性变化/组织变形 不存在 2 中度水肿形成 1 严重水肿伴细胞和/或纤维破坏，纤维蛋白沉积 0 炎症 无炎症细胞浸润 3 轻度炎症细胞浸润 2 中度炎症细胞浸润 1 重度炎症细胞浸润 0 1.8 免疫荧光染色
首先，将新鲜跟腱组织浸泡在质量浓度为40 g/L的多聚甲醛中过夜固定；然后，使用质量浓度分别为150、300 g/L的蔗糖溶液梯度脱水，用OCT包埋；接着，使用冰冻切片机切片(冰冻切片厚度为8 μm)；继而，使用抗体稀释液室温孵育1 h，分别加入稀释的COX2 Antibody(1∶100)、CD31 Antibody(1∶100)、PDGFB Antibody(1∶100)和HIF-1α Antibody(1∶100)，置于湿盒中，于4℃冰箱保存过夜；最后，加入COX2、PDGFB antibody的切片以及加入CD31、HIF-1α antibody的切片分别加入稀释的羊抗兔二抗(1∶1 000)、羊抗鼠二抗(1∶1 000)，置于湿盒中室温孵育2 h，滴加DAPI封片，荧光拍照显微镜下拍照观察。
1.9 高效液相色谱法分析白刺花种子中各生物碱的质量分数
参考文献[8]，采用高效液相色谱法(High-Performance Liquid Chromatography，HPLC)测定白刺花种子提取物中各生物碱的质量分数。
1.10 分子对接验证
首先，参考文献[9]，从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载生物碱的3D结构并保存成格式为.pdb的文件，在RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载蛋白大分子3D结构文件；然后，利用Autodock vina软件[9]，进行生物碱及蛋白大分子的半柔性对接，并计算结合能；最后，采用PyMOL2.5软件[9]作图，展示分子对接细节。
1.11 统计分析
本研究应用SPSS 21对各实验数据进行分析，应用Origin 8.0作图，实验数据采用均数±标准差表示，各组间大鼠的数据比较采用单因素方差分析。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2. 实验结果
2.1 白刺花总碱对跟腱损伤的SD大鼠的AFI的影响
SD大鼠跟腱损伤后，未发生严重感染；在损伤后第1周，损伤侧后肢出现比较严重的跛脚步态，第2周开始恢复。利用SD大鼠跟腱损伤后的步态分析计算AFI值，从而考察了SVA对SD大鼠跟腱损伤后功能恢复的影响。AFI值越低，表示跟腱功能越差。由实验结果(图 3)可知：损伤前1 d，各组大鼠的AFI值为-15左右；损伤后第1 d，各组AFI值降到-50左右；损伤后第7 d，各组AFI值均无显著变化；损伤后第14 d，各组AFI值均显著增加，且损伤+SVA 7 d处理组的AFI值显著高于损伤+DMSO 7 d组；损伤后第21 d，损伤+SVA 7 d组的AFI值仍然显著高于正常对照组，而损伤+SVA 14 d组的AFI值更高，接近正常水平。由此可知，SVA对跟腱损伤后的功能恢复具有的促进作用，在损伤后第14 d施加有较好的疗效。
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图 3 SVA对跟腱损伤的SD大鼠的AFI的影响(n=3)注：与正常对照组比较：*表示P < 0.05。Figure 3. Effect of SVA on AFI in SD rats with Achilles tendon injury(n=3)2.2 SD大鼠跟腱修复的形态观察
损伤后第21 d，麻醉处死各组SD大鼠，解剖剥离跟腱进行形态学观察，发现各实验组都表现出较为严重的血管新生导致的肉芽组织粘连和增生，但损伤+SVA 7 d组损伤部位的炎性物质水平低于损伤+DMSO 7d组，肉芽组织增生和粘连情况有所缓解，组织渗出物减少，而损伤+SVA 14 d组损伤部位的炎性物质水平更低，肉芽组织增生和粘连情况进一步缓解，组织渗出物更少。如图 4，损伤+SVA 14 d组的形态学评分高于损伤+DMSO 7 d组、损伤+SVA 7 d组。
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图 4 SVA对SD大鼠损伤跟腱形态学的影响(n=3)注：与正常对照组比较：**表示P < 0.01。Figure 4. Effect of SVA on morphology of injured Achilles tendon in SD rats (n=3)2.3 SVA对SD大鼠跟腱损伤组织结构的影响
在损伤后第21 d，将各组大鼠跟腱组织进行冷冻切片，并进行组织染色分析。由结果(图 5)可知：(1)H&E染色显示正常对照组的肌腱组织胶原纤维染色均匀，走形一致，细胞形态规则，细胞外基质含量较高，细胞平行排列在其中，核质均匀，数量较少；Masson染色中可见胶原纤维丰富，未见其他明显异常。损伤后，H&E染色中可见细胞排列紊乱，成纤维细胞增生和大量的炎性细胞浸润；Masson染色中可见细胞排列变得杂乱无序和胶原纤维细胞数量明显增加。(2)SVA处理后，由H&E染色结果可知，损伤+SVA 7 d组的细胞数量低于损伤+DMSO 7 d组，而细胞外基质含量高于损伤+DMSO 7 d组；Masson染色结果表明，与损伤+DMSO 7 d组相比，损伤+SVA 7 d组的胶原细胞的排列更有序且含有更加丰富的胶原纤维；组织学评分显示损伤+SVA 7 d组的组织学分数高于损伤+DMSO 7 d组。(3)与损伤+SVA 7 d组相比，损伤+SVA 14 d组的细胞数量更少，细胞外基质含量更高，胶原细胞的排列和胶原纤维的丰富度接近正常的肌腱组织，组织学评分也更高。
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图 5 SVA对SD大鼠损伤跟腱组织学的影响(n=3)注：与正常对照组比较：**表示P < 0.01。Figure 5. Effect of SVA on histology of injured Achilles tendon in SD rats (n=3)2.4 SVA对SD大鼠跟腱炎症因子和血管新生相关因子表达的影响
由免疫荧光染色结果(图 6)可知：正常跟腱组织炎症因子环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX2)、血管内皮标志分子CD31以及血管生成相关的因子HIF-1α、PDGFB均无显著表达；损伤后，这4种因子的荧光强度均显著上调；与损伤+DMSO 7 d组相比，损伤+SVA 7 d组以上几种因子的荧光强度的上调有所回复；与损伤+SVA 7 d组相比，损伤+SVA 14 d组的这4种因子上调的荧光强度更低，且更接近于正常对照组。这说明在跟腱损伤后第14 d使用SVA处理可能更好地抑制了炎症因子以及炎症因子导致的血管新生，从而更有利于跟腱的修复。
2.5 SVA中槐果碱和氧化槐果碱对血管新生相关因子的影响
使用HPLC法对贵州几个地方产的白刺花的种子的各生物碱的质量分数进行测定，由结果(表 3)可知其氧化槐果碱的质量分数远远超过槐果碱。
表 3 白刺花种子中各生物碱的质量分数Table 3. Mass fraction of alkaloids in the seeds of Sophora Viciifoliamg·g-1 批号 名称 N-甲基野靛碱 野靛碱 苦参碱 槐果碱 槐定碱 氧化槐果碱 氧化苦参碱 S12 贵州西秀1 0.50 1.34 0.24 0.46 0.65 11.41 7.10 S13 贵州关岭2 0.27 0.73 0.32 0.52 0.72 11.45 7.65 S14 贵州云岩3 0.53 1.39 0.26 0.51 0.68 11.32 6.98 S15 贵州云岩4 0.54 1.45 0.26 0.51 0.70 12.06 7.76 均值 0.46 1.23 0.27 0.50 0.69 11.56 7.37 SD值 0.13 0.33 0.04 0.03 0.03 0.34 0.39 使用Autodock vina软件对槐果碱和氧化槐果碱与HIF-1α和PDGFB进行分子对接，结果(图 7)显示：槐果碱与HIF-1α、PDGFB的结合能分别为-6.8、-6.5；氧化槐果碱与HIF-1α、PDGFB的结合能分别为-6.8、-5.8，均有较好的结合力。
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图 7 槐果碱、氧化槐果碱与HIF-1α、PDGFB的分子对接图Figure 7. Molecular docking diagram of sophorine and oxysophorine with HIF-1α and PDGFB3. 讨论
本实验通过H&E染色发现损伤位点处大量炎症细胞浸润，炎症细胞分泌炎症因子，例如COX2和PGE2。COX2已被证实是肌腱炎症的重要指标因子[3]、可以诱导下游PGE2的高表达[10]，PGE2可引起血管舒张并触发痛觉[10]，而在肌腱修复早期，新生血管可为损伤肌腱的修复提供营养物质，因此，新生血管的形成是必要的[11]。然而，新生毛细血管是肉芽组织的主要结构，过度的血管生成会加剧肉芽组织、疤痕、粘连的形成[12]，导致疼痛和功能障碍，进一步导致大鼠行走时的步态恶化。不同程度的粘连会发生在多数肌腱损伤病例中，是肌腱修复疗效不佳的重要原因[2]，因此，SVA提高SD大鼠损伤跟腱的功能恢复与抗肉芽组织、疤痕、粘连的形成有关。
肌腱损伤的修复主要包括3个重叠的阶段[13]。第一阶段是炎症阶段，在最初的24 h内，巨噬细胞吞噬坏死物质，刺激肌腱细胞增殖。几天后开始增殖期，肌腱粘多糖浓度和含水量维持在较高水平，纤维组织增生，开始合成胶原纤维。约6周后，进入第二阶段——重建阶段，细胞的代谢处于较高水平，肌腱修复从细胞水平变为纤维水平，胶原蛋白I高比例合成，肌腱细胞和胶原纤维向应力方向平行排列。10周后，进入第三阶段——成熟阶段。在长达一年的成熟阶段里，肌腱组织的血管分布减少，细胞代谢率显著下降，且在成熟阶段后半段，纤维组织逐渐变成疤痕样肌腱组织。血管新生因子在各阶段的表达高低影响损伤肌腱的修复状况[3]，血管新生因子的表达高峰在损伤后第7~10 d，在第一阶段发挥关键调控作用[14-15]。
我们前期的研究结果[3]显示，PDGFB是肌腱伤口部位血管生成的主要调节因子。YOUNESI等[16]发现伤后肌腱组织修复区因炎症反应造成缺氧，HIF-1α的表达上调，导致PDGFB表达的上调，表达的高峰在损伤后的第7~10 d，随着愈合发展，PDGFB的表达逐渐减弱。本研究也得到了类似的结果，并且发现在损伤后第7 d时使用SVA处理损伤跟腱，虽然也取得一定的治疗效果，但可能由于这个时期肌腱高表达的炎症因子和PDGFB促进血管新生，对肌腱修复仍有正向的作用；在损伤后第14 d时加入SVA处理，可更有效地抑制HIF-1α和PDGFB的过度表达，达到抑制外源性愈合，减轻肌腱粘连和疤痕的目的。
血管新生因子对胶原III的合成具有关键作用，胶原III构成肌腱的骨架，其结构决定肌腱的力学特性[17]。在大鼠损伤肌腱的修复过程中，经过短暂的炎症期进入增殖期；胶原III在增殖期合成，并逐渐达到高峰；增殖期一般最长可持续6周[18]。本研究的SD大鼠损伤修复跟腱收集是在损伤后第21 d，肌腱修复刚进入增殖期，如Masson染色所示正常对照组的胶原整齐排列，然而损伤各组的胶原含量降低、纤维排列紊乱。此外，胶原交联程度、分泌量和排列也影响肌腱力学特性。与损伤+SVA 7 d组相比，损伤+SVA 14 d组的细胞数量减少，细胞外基质比例增加，胶原细胞的排列更为有序且含有更加丰富的胶原纤维，接近正常对照组的肌腱组织；可能由于早期的修复过程中新生血管为胶原III的形成提供营养，是有利于肌腱修复的；而在损伤后第14 d，过度的血管新生可能分泌基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)等因子，妨碍胶原III的形成[19]，此时加入SVA可抑制血管新生，有利于胶原III的合成。
4. 结论
本文成功构建了SD大鼠跟腱损伤动物模型，外源注射SVA后，从组织结构和功能恢复等方面检测了SVA对SD大鼠损伤跟腱修复的影响。主要结论如下：
(1) SVA增加修复跟腱的AFI值，说明SVA促进SD大鼠损伤跟腱功能修复。
(2) 组织学检测结果显示SVA抑制肉芽组织形成，减少粘连和瘢痕，促进胶原纤维的整齐排列，提示SVA可能通过抑制过度的血管新生来抑制肉芽组织形成，减少粘连和瘢痕，进而促进损伤跟腱的早期修复，而在损伤后第14 d加入SVA作用能取得更好的效果。
(3) 免疫荧光和分子对接等实验证实SVA可以抑制损伤跟腱COX2、HIF-1α、PDGFB和血管内皮的标记CD31的高表达，而在损伤后第14 d加入SVA的抑制效果更明显。初步阐明了SVA通过调控炎症和血管新生信号通路来促进损伤跟腱修复的机制。
本文通过大鼠在体实验，研究了SVA对SD大鼠损伤跟腱修复的影响，从作用血管新生信号通路新的靶点方面阐述了SVA相较于HDACIs药物的优点，但两者均纯在一定的拟交感神经、中枢神经和自主神经毒性，未对两者的毒副作用进行比较研究，在临床应用方面缺乏一定安全性，未来开发SVA药物还需要提供动物体内安全性更多的数据。
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图 3 SVA对跟腱损伤的SD大鼠的AFI的影响(n=3)
注：与正常对照组比较：*表示P < 0.05。
Figure 3. Effect of SVA on AFI in SD rats with Achilles tendon injury(n=3)
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图 4 SVA对SD大鼠损伤跟腱形态学的影响(n=3)
注：与正常对照组比较：**表示P < 0.01。
Figure 4. Effect of SVA on morphology of injured Achilles tendon in SD rats (n=3)
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图 5 SVA对SD大鼠损伤跟腱组织学的影响(n=3)
注：与正常对照组比较：**表示P < 0.01。
Figure 5. Effect of SVA on histology of injured Achilles tendon in SD rats (n=3)
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图 7 槐果碱、氧化槐果碱与HIF-1α、PDGFB的分子对接图
Figure 7. Molecular docking diagram of sophorine and oxysophorine with HIF-1α and PDGFB
指标 得分 指标 得分 跛行 肿胀和发红的肌腱 左脚完全跛行 1 没有肿胀/不发红 2 左脚不完全跛行 0 可见肿胀，无发红 1 连接肌腱和皮肤/滑动 可触到的红肿 0 不是黏附的，滑动的 1 邻近的肌腱 黏附性，不能完全滑动 0 未改变的 1 肌腱破裂 改变(颜色、厚度和表面) 0 不存在 1 肌腱的形状 存在 0 正常的 3 炎症 略增厚 2 不存在 1 中等增厚 1 存在(水肿、肿胀和发红) 0 强烈的增厚 0 手术区域的肌腱表面 肌腱的颜色 完好无损，光滑 1 亮白色 1 不均匀的，粗糙的 0 半透明，暗白色，玫瑰色 0 肌腱/腱旁和筋膜，可滑动 肌腱的单应变 不附着的，可移动的 1 正常的结合 1 附着的，而不是滑动的 0 粘连，严重并生的 0 
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指标 得分 肌腱的ECM组织 胶原纤维呈波浪形，紧密平行排列 2 部分紧凑，部分松散或无序 1 松散，不有序(肉芽组织) 0 细胞/胞外基质比例 生理的 2 局部细胞密度增加 1 细胞密度增加或ECM的质量分数减小 0 细胞排列 单轴的 2 超过10%的区域细胞排列不规则 1 超过50%的细胞没有单轴对齐 0 细胞分布 均匀的、生理的 1 细胞密度升高(细胞聚集) 0 细胞核形态 主要是伸长的异色细胞核(肌腱细胞) 2 超过10%的细胞具有多形性、卵圆形、异色、大或正色细胞核 1 主要是直径10 μm以上、卵圆形、着色或多形、异色细胞核 0 肌腱的修复组织 均匀的(组成相似的整个组织) 2 局部异质组织组成 1 整个组织成分完全改变 0 愈合组织的形态 正常的，只在手术区域，局部受限 1 强壮的，改变整个肌腱，组织增厚 0 退行性变化/组织变形 不存在 2 中度水肿形成 1 严重水肿伴细胞和/或纤维破坏，纤维蛋白沉积 0 炎症 无炎症细胞浸润 3 轻度炎症细胞浸润 2 中度炎症细胞浸润 1 重度炎症细胞浸润 0
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表 3 白刺花种子中各生物碱的质量分数
Table 3 Mass fraction of alkaloids in the seeds of Sophora Viciifolia
mg·g-1 批号 名称 N-甲基野靛碱 野靛碱 苦参碱 槐果碱 槐定碱 氧化槐果碱 氧化苦参碱 S12 贵州西秀1 0.50 1.34 0.24 0.46 0.65 11.41 7.10 S13 贵州关岭2 0.27 0.73 0.32 0.52 0.72 11.45 7.65 S14 贵州云岩3 0.53 1.39 0.26 0.51 0.68 11.32 6.98 S15 贵州云岩4 0.54 1.45 0.26 0.51 0.70 12.06 7.76 均值 0.46 1.23 0.27 0.50 0.69 11.56 7.37 SD值 0.13 0.33 0.04 0.03 0.03 0.34 0.39
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