鲮鱼属鲤科鱼类，是华南地区的重要经济鱼类。硫酸铜是水体养殖中常用的杀虫抑菌剂，Cu²⁺可破坏寄生虫体内氧化还原酶系统活性(如巯基酶)，阻碍虫体代谢，能对寄生虫起到杀灭作用，因此Cu²⁺被用于治疗鱼类寄生虫病。此外，Cu²⁺对青泥苔、蓝藻等有害生物也具有较强的杀灭作用^[1]，Cu²⁺还被用于控制或杀灭蓝绿藻等有害藻类并抑制其爆发。硫酸铜本身具有一定毒性，大量使用或滥用反而会影响鱼体生长，甚至蓄积到生物体内引起水环境污染。例如：过量Cu²⁺会吸附在鱼鳃组织上，致使鳃部产生大量黏液，导致鳃丝及鳃片脱落，形成大量血窦，从而阻碍鱼体的氧气交换，造成鱼的死亡；Cu²⁺过量可富集于鱼体肝脏、肾脏等主要器官，对鱼类的组织器官、消化系统、免疫系统、神经系统乃至胚胎发育会造成不良影响^[2-4]，从而影响生物链平衡。

不同种类、规格和状态的鱼可耐受Cu²⁺的毒性能力不同^[5-7]，在不污染环境的前提下，如何正确使用硫酸铜作杀虫抑菌剂，这需要科学地评估鲮鱼对硫酸铜急性毒性的耐受性。虽然已有关于硫酸铜的急性毒性实验研究^[8-10]，但对鲮鱼苗的研究尚少。本文主要围绕鲮鱼苗对硫酸铜的耐受性，通过不同质量浓度的硫酸铜溶液模拟药浴过程，探究鲮鱼苗培育过程中合理施药的理论依据，以期提高鲮鱼苗成活率和降低硫酸铜对水环境的污染。本文若无注明，某些毒性学浓度术语中的“浓度”特指质量浓度。

1.   实验部分

1.1   试剂与仪器

实验用鱼为鲮鱼苗养殖基地的幼鱼，剔除老、弱、病、残等鱼苗，暂养于圆桶形养殖缸中(直径50 cm，水深75 cm)，水温26~28 ℃，正常投饲、换水、曝气充氧，试验前1 d暂停投喂。

主要试剂：硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)、乙二胺四乙酸、柠檬酸铵、氨水、氯化铵、淀粉、二乙基二硫代氨基甲酸钠等均为市售，分析纯。实验所用超纯水为实验室自制。

主要仪器与用品：紫外分光光度计(UV mini-1280，日本岛津)、火焰原子吸收分光光度计(AA-7000，日本岛津)、方形养殖缸(长50 cm，宽20 cm，水深20 cm)。

1.2   研究方法

硫酸铜对鲮鱼苗的急性毒性试验在方形养殖缸(蓄水体积20 L)中进行，试验用水为经循环水过滤系统处理的自来水，水质符合GB 11607-1989《渔业水质标准》，试验前提前曝气充氧，试验期间不充氧、不投喂。

制备质量浓度为15 g/L的硫酸铜母液，稀释为5种Cu²⁺质量浓度梯度(0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L)的药浴溶液，注入方形养殖缸，每个养殖缸内投入10尾鱼苗，每种质量浓度做2个平行实验。试验周期为7 d，期间记录鱼苗的存活、运动、摄食等情况。

投入鱼苗前，从养殖缸中取50 mL溶液测定Cu²⁺质量浓度；投入鱼苗后，用油性笔标记鱼缸液面高度；每24 h观察鱼苗，及时捞出死亡鱼苗，记录死亡数量并测量其长度、质量，补充试验用水至标记处；7 d试验结束时再次从养殖缸中取50 mL溶液测定Cu²⁺质量浓度。

1.3   铜离子质量浓度的测定方法

1.3.1   二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)光度法^[11]

采用DDTC光度法测定Cu²⁺的质量浓度ρ(Cu²⁺)，Cu²⁺与络合剂DDTC在pH为8.0~9.5的氨性缓冲溶液中生成黄棕色化合物，并在440 nm波长处有最大吸收。具体实验步骤：(1)标准曲线的绘制，分别移取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.25、0.30 mL铜标准溶液(0.005 mg/mL)于12支具塞比色管中，加水至25 mL，加入5.0 mL乙二胺四乙酸-柠檬酸铵溶液、5.0 mL氨-氯化铵缓冲溶液、1 mL淀粉溶液以及5.0 mL二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液，充分摇匀10 min，然后移入容积为2 cm的比色皿中，在440 nm波长处，以水为参比，测量吸光度。以吸光度对ρ(Cu²⁺)作图，绘制标准曲线。(2)试样测定，直接取25.00 mL酸化后的水样于容积为50 mL的比色管中，按步骤(1)中标准曲线的方法测定吸光度，除去试剂空白后，从标准曲线上查得ρ(Cu²⁺)。

1.3.2   火焰原子吸收分光光度法

采用火焰原子吸收分光光度法测定ρ(Cu²⁺)。具体步骤：(1)标准曲线的绘制，配制一系列标样溶液，使得ρ(Cu²⁺)依次为0、6.25×10^-8、1.25×10^-7、2.50×10^-7、5.00×10^-7、1.00×10^-6、2.00×10^-6、4.00×10^-6 g/L，采用0.45 μm孔径的微孔滤膜过滤后，按文献[12]的色谱条件上机测定。(2)同法过滤实验前以及实验7 d后的各种水样，上机测定样品中Cu²⁺的吸光度，代入标准曲线，可测得水样中ρ(Cu²⁺)。

2.   结果与讨论

2.1   鲮鱼苗的死亡情况

2.1.1   累计死亡率曲线

与空白对照组相比，鲮鱼苗在ρ(Cu²⁺)=0.25 mg/L的硫酸铜溶液中浸泡7 d，活力无明显差异、无死亡、应激或中毒症状；而其他质量浓度梯度均有鱼苗死亡现象，随ρ(Cu²⁺)的增大，累计死亡率依次上升(图 1)，累计死亡率曲线均呈上升趋势，至5 d时进入平台期。鲮鱼苗在ρ(Cu²⁺)=0.50 mg/L的硫酸铜溶液中浸泡3 d时出现首尾鱼死亡，7 d时累计死亡率 < 50%；鲮鱼苗在ρ(Cu²⁺)=1.00、2.00 mg/L的硫酸铜溶液中浸泡1 d时出现首尾鱼死亡，随后鱼苗陆续死亡，累计死亡率上升速度较快，并于5 d时死亡率达到100%。

图  1  鲮鱼苗在硫酸铜溶液中的累计死亡率曲线

Figure  1.  Cumulative mortality rate curve of mud carp in copper sulfate solution

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2.1.2   累计死亡率与lg[ρ(Cu²⁺)]的关系

当ρ(Cu²⁺)≤0.5 mg/L时，在浸泡的2 d时间内，未出现鲮鱼苗死亡的现象；而当ρ(Cu²⁺)>0.5 mg/L时，鲮鱼苗浸泡1 d和2 d的累计死亡率与ρ(Cu²⁺)的对数呈正相关的线性关系(图 2)。

图  2  鲮鱼苗累计死亡率与lg[ρ(Cu²⁺)]的关系图

Figure  2.  Relationship between cumulative toxicity of mud carp and lg[ρ(Cu²⁺)]

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浸泡1 d的线性回归方程为：

浸泡2 d的线性回归方程为：

根据百分数与概率单位对照表可知1.91≤y≤8.09，因此-0.33≤x_1d≤0.66及-0.35≤x_2d≤0.64，对应的ρ(Cu²⁺)区间分别为[0.47, 4.57] mg/L和[0.45, 4.37] mg/L；同时可认为鱼苗累计死亡率与ρ(Cu²⁺)的对数在x_1d ≤-0.33和x_2d ≤-0.35范围内呈线性关系，线性回归方程为y=1.91，对应ρ(Cu²⁺)区间分别为[0, 0.47]和[0, 0.45] mg/L。

随着浸泡时间延长，在3 d和4 d时，鲮鱼苗的累计死亡率与ρ(Cu²⁺)的对数呈正相关(图 2)。线性回归方程分别为：

根据百分数与概率单位对照表可知，1.91≤y≤8.09，因此-0.63≤x_3d≤0.75及-0.58≤x_4d≤0.28，对应的ρ(Cu²⁺)区间分别为[0.23, 5.62] mg/L和[0.26, 1.91] mg/L。

当鲮鱼苗在ρ(Cu²⁺)≤1 mg/L的硫酸铜溶液中浸泡5、6、7 d的累计死亡率与ρ(Cu²⁺)的对数呈正相关线性关系(图 2)，且6、7 d时的累计死亡率完全相同，故5 d时的线性回归方程为：

由于1.91≤y≤8.09，因此-0.58≤x_5d≤0.02，对应的ρ(Cu²⁺)区间为[0.26, 1.05] mg/L；而6、7 d时的线性回归方程为：

因为1.91≤y≤8.09，所以-0.58≤x_6d/7d≤0.02，对应ρ(Cu²⁺)区间为[0.25, 1.05] mg/L。鲮鱼苗在ρ(Cu²⁺)>1 mg/L的硫酸铜溶液中浸泡5、6、7 d时的累计死亡率均为100%，即在x≥0.02时，鱼苗累计死亡率与ρ(Cu²⁺)的对数呈线性关系，线性回归方程为y=8.09，即ρ(Cu²⁺)区间为[1.05, +∞)。

2.2   半致死浓度(LC₅₀)与安全浓度(SC)

采用直接回归法^[13-14]，当累计死亡率(概率单位)为5时，可求得硫酸铜对鲮鱼苗的半致死浓度(LC₅₀)，不同观察时段的安全浓度SC计算公式为：

其中n表示浸泡天数，LC₅₀×n表示第n天硫酸铜对鲮鱼苗的半致死浓度。

不同浸泡时间的硫酸铜对鲮鱼苗的半数致死浓度(LC₅₀)不同(表 1)，随着鱼体在硫酸铜溶液中浸泡时间的延长，LC₅₀逐渐降低。例如LC₅₀(1 d)为1.461 2 mg/L，LC₅₀(2 d)为1.398 6 mg/L，LC₅₀(4 d)为0.707 0 mg/L，LC₅₀(7 d)为0.512 0 mg/L。LC₅₀随时间的变化曲线呈“Z”形，5 d后进入平台期(图 3)。由此可见，随着鱼体在硫酸铜溶液中暴露时间的延长，鱼体对硫酸铜急性毒性的敏感性增强，7 d的半数致死浓度降低到1 d时的35%。该结果表明，Cu²⁺对鱼鳃造成损伤进一步破坏了鱼体呼吸系统，从而影响循环系统改变鱼体的自身抗逆性。随着暴露时间的延长，鲮鱼苗有可能在铜离子质量分数ρ(Cu²⁺)较低的情况下也会死亡。因此，暴露时间延长时，安全浓度降低。

表  1  各观察时段节点硫酸铜对鲮鱼苗的半致死浓度及其安全浓度

Table  1.  LC₅₀ of copper sulfate and its safe concentration on mud carp in dirrerent observation stages

浸泡时长/d	回归方程	lg(LC50)	LC50/(mg·L-1)	SC/(mg·L-1)
1	y=6.253 7x+3.969 9 (R2=0.974)	0.164 7	1.461 2	0.146 1
2	y=6.253 7x+4.088 6 (R2=0.931)	0.145 7	1.398 6	0.139 9
3	y=4.473 9x +4.740 6 (R2=0.986)	0.058 0	1.142 9	0.114 3
4	y=7.176 5x +6.080 9 (R2=0.986)	-0.150 6	0.707 0	0.070 7
5	y=10.264 0x+7.865 0 (R2=0.984)	-0.279 1	0.525 9	0.052 6
6	y=10.264 0x +7.983 6 (R2=0.996)	-0.290 7	0.512 0	0.051 2
7	y=10.264 0x +7.983 6 (R2=0.996)	-0.290 7	0.512 0	0.051 2

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图  3  不同浸泡时间的半致死浓度变化

Figure  3.  The change of semi-death concentration under different soaking time

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2.3   毒性累积程度(MAC)

毒性累积程度在实际应用中常被用于评价鱼苗对化合物的蓄积情况。根据式(2)可以求出不同观察时段的MAC，以浸泡时间为横坐标，MAC为纵坐标，可得毒性累积情况变化曲线(图 4)，ΔLC₅₀表示最初观察点与实验结束时的半致死浓度差，ΔLC₅₀n表示某观察时间节点的半致死浓度差值。鲮鱼苗对硫酸铜溶液的蓄积曲线呈“S”形，第1 d至第5 d的MAC逐步上升，最高可达100%，从第5 d起，MAC保持稳定。由此可见，硫酸铜在鲮鱼苗体内的蓄积量逐步递增，验证了硫酸铜在鱼体内存在蓄积现象的猜测。

图  4  鲮鱼苗在硫酸铜溶液中的累积毒性

Figure  4.  The cumulative toxicity of mud carp fry in copper sulfate solution

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2.4   铜离子的质量浓度分析

依据水样中ρ(Cu²⁺)与吸光度的关系来绘制标准曲线。通过线性拟合可得线性回归方程：

相关性良好，可用于测定ρ(Cu²⁺)。同法测定实验前和实验后水样中的ρ(Cu²⁺)。对比实验前后的结果发现，实验后水样中ρ(Cu²⁺)均有所下降(图 5A)。由此证明，水体中的Cu²⁺可进入鱼苗体内，导致溶液中ρ(Cu²⁺)下降，说明Cu²⁺在鱼体内可能存在蓄积现象。

图  5  紫外分光光度法和原子吸收法测定实验前后水体中的ρ(Cu²⁺)

Figure  5.  The ρ(Cu²⁺) in water before and after the experiment tested by ultraviolet-visible spectrophotometry and atomic absorption spectrophotometry

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测定并绘制标准曲线，得到线性回归方程为：

拟合结果相关性良好，可用于测定ρ(Cu²⁺)。同法测定实验前和实验后水样中的ρ(Cu²⁺)。对比实验前后的结果发现，实验后水样中ρ(Cu²⁺)均有所下降(图 5B)，与紫外分光光度法的分析结果一致。水体中Cu²⁺的质量浓度减少表明Cu²⁺可能转移到鱼苗体内。

2.5   死亡鱼体的体长及质量与ρ(Cu²⁺)的关系

当ρ(Cu²⁺)≤0.25 mg/L时，鱼苗未出现中毒及死亡现象(图 6A)；适当提高ρ(Cu²⁺)至0.50 mg/L，浸泡时间2 d时体长较短的小鱼苗开始死亡，4 d后体长较长的大鱼苗开始死亡；进一步提高ρ(Cu²⁺)至1.00 mg/L，鱼苗死亡所需浸泡时间缩短至1 d，开始死亡鱼苗的体长比低浓度实验组的长。鲮鱼苗在ρ(Cu²⁺)>1.00 mg/L的硫酸铜溶液中暴露时，浸泡时间是影响鱼苗死亡的主要因素，时间越长，鱼苗死亡率越高。鱼苗对抗硫酸铜毒性作用的能力与鱼苗质量相关(图 6B)，小鱼苗质量轻，代谢能力弱，致使其中毒死亡的剂量较小，而大鱼苗体型较长且质量较大，代谢能力相对较强，致使鱼苗中毒死亡的剂量相对较大。随着浸泡时间的延长，硫酸铜在破坏鱼体呼吸系统的同时在体内不断蓄积破坏鱼苗自身的抗逆性，从而导致大鱼苗中毒死亡。

图  6  死亡鱼苗的平均体长、质量与浸泡时间的关系

Figure  6.  The relationship between the average body length, average mass, and immersion time of deceased fish fry

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2.6   鲮鱼苗对硫酸铜的急性毒性耐受性

根据鲮鱼苗累计死亡率与lg[ρ(Cu²⁺)]呈线性关系，选用直接回归法推算出试验期间1~7 d的LC₅₀，以1 d和2 d的LC₅₀为准，与相关研究结果^[15-19]对比(表 2)表明，硫酸铜对鲮鱼苗的LC₅₀低于丁鱥、鲢、厚颌鲂、中国花鲈、梭鲈、昆明裂腹鱼、斑马鱼等常见淡水鱼，可见鲮鱼苗对硫酸铜的急性毒性耐受性较差。

表  2  不同种类鱼苗浸泡1、2 d时的LC₅₀

Table  2.  LC₅₀ at 1 and 2 days of immersion for different species of fish fry

种类	LC50/(mg·L-1)
	1 d	2 d
丁鱥	10.43	6.02
鲢	7.71	6.11
厚颌鲂	5.04	4.13
中国花鲈	4.63	4.15
梭鲈	2.58	2.35
昆明裂腹鱼	2.52	2.05
斑马鱼	2.35	1.28
刀鲚	1.09	1.06
草鱼	0.34	0.31
花鱼骨	0.27	0.23
1龄短须裂腹鱼苗	1.018	0.870
鲮鱼苗(本研究)	1.461 2	1.398 6

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据国家标准《化学农药环境安全评价试验准则第12部分：鱼类急性毒性试验》(GB/T31270.12-2014)规定，以鱼苗96 h的半致死浓度为准，可将农药对鱼类毒性划分为4个等级：(1)小于0.1 mg/L为剧毒；(2)0.1~1 mg/L为高毒；(3)1~10 mg/L为中毒；(4)大于10 mg/L为低毒^[20]。本研究中硫酸铜对鲮鱼苗96 h(4 d)的LC₅₀为0.707 0 mg/L，属于高毒农药。

从硫酸铜对鲮鱼苗的安全浓度SC进行分析，1 d的SC为0.146 1 mg/L，随着浸泡时间的延长，SC呈现逐步下降的趋势，第7 d时SC降至0.051 2 mg/L。一般情况下，水产养殖通常采用全池泼洒硫酸铜(0.357~0.500 mg/L)并对鱼苗进行浸泡，或者拉网集中后以7.143 mg/L的硫酸铜溶液进行短时间药浴，所用硫酸铜质量浓度均高于鲮鱼苗的安全浓度，因此直接套用常用质量浓度对鲮鱼苗养殖基地的鱼池进行杀虫是不合理的。

3.   结语

硫酸铜作为广谱杀虫剂，在水产养殖中应用非常广泛，良好的杀虫效果与其较大的毒性密不可分，硫酸铜对鲮鱼苗的急性毒性可列为高毒农药，鲮鱼苗对其耐受性较低，本研究结果再次证实“硫酸铜会在鲮鱼苗体内蓄积”这一观点，考虑到浸泡时间延长时安全浓度明显下降，故建议在实际生产中采用高浓度短时间药浴法，既保证杀虫效果，又不会对鱼苗造成毒害。