New Insights into Biological Effects of Disinfectants Against Bacteria Exploiting Biospectroscopy Techniques Coupled with Multivariate Analysis
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摘要: 利用傅立叶变换红外光谱研究了次氯酸钠、过氧化氢和紫外线对革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichia coli)和革兰氏阳性海氏肠球菌(Enterococcus hirae)的生物学效应。结果表明：细菌失活和光谱变化之间存在显著的相关性，而且不同消毒剂和细菌引起的效果曲线也明显不同。革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌更容易受消毒剂的影响。NaClO对膜透性、蛋白质和脂类氧化的生物效应最为显著，其次是H2O2光解产生的HO ·自由基的氧化效应，最后是紫外辐射对DNA的损伤作用。研究结果为了解消毒过程的生物效应提供了新的见解，并为优化消毒过程、确保水安全提供了科学依据。Abstract: The biological effects of NaClO, H2O2 or UV towards gram-negative Escherichia coli and gram-positive Enterococcus hirae were investigated by using FTIR microspectroscopy. The results show significant correlations between bacterial inactivation and spectral alterations, and also distinctly different effects profiles induced by the different disinfectants and bacteria. Gram-negative bacteria were more vulnerable to disinfection than gram-positive bacteria. The most significant biological effects on membrane permeability and oxidation of proteins and lipids were observed for NaClO, followed by the oxidation effects of HO · radicals generated with photolysis-of H2O2, and lastly through DNA damage by UV radiation. The findings provide new insights into the biological effects of disinfection processes, and a scientific basis for optimization to ensure the water safety.
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Keywords:
- biospectroscopy /
- biological effects /
- disinfection /
- hydrogen peroxide /
- UV radiation
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饮用水加氯消毒是最常用的城市水消毒方法[1]。为确保饮用水安全，我国生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)要求自来水厂出水余氯质量浓度大于0.3 mg/L，管网末端水中余氯质量浓度大于0.05 mg/L，可确保饮用水中的生物指标达标，防止一些细菌(如大肠杆菌)危害人类健康。据报道，在南亚和撒哈拉以南的非洲，由于供水和卫生条件差，因腹泻死亡的人数占全球腹泻死亡人数的87%[2]。因此，在日常生活中，消毒必不可少，各种消毒方法已被应用于水行业，如氯、紫外线辐射、臭氧或超氧化物消毒[3]。疫情期间，为做到高效精准消毒，对清洁程序进行了加强并且增加了消毒剂的使用量，亟需了解各种消毒剂的灭活能力及其消毒机理，以评价其消毒效果，提高消毒效率。
国内外对消毒剂消毒效果的评价方法主要是定量灭活试验[4]。通过观察消毒前后细菌和病毒等微生物含量的减少情况来表征消毒效果[5]。病毒所处环境对化学消毒剂灭活病毒的效果会产生较大影响，所以模拟实验需要考虑选取不同的实验干扰条件，来预测消毒效果可能存在的偏差[6]。目前的消毒效果评价方法较为复杂，人们对消毒剂在分子水平消毒机制的理解仍然有限，细菌失活和生物效应之间的关系迄今尚不清楚。而利用生物光谱技术结合多元统计分析，探索细菌失活与生物效应之间的关系，有望实现通过图像以及数据分析直观快速地评价消毒效果。
傅立叶变换红外(FTIR)光谱作为一种表征和鉴定生物材料的有力工具，与多元统计分析相结合，可以在分子水平上增进消毒机理的研究。FTIR已被广泛应用于环境监测[7]、毒理学研究[8]和病理诊断[9]。该方法的优点是无破坏性、无试剂、易于操作和可获取详细的生化信息[7, 10-11]。当生物样品与红外光相互作用时，生物分子中的化学键吸收辐射并产生红外吸收光谱[12]。每种生物都有其独特的振动模式，包括峰位置、峰高和峰形信息，这些信息构成了生物材料的“指纹”[12-14]。因此，使用生物光谱法，可表征消毒前后生物分子的变化情况，进而通过多元统计分析快速评估消毒效果。主成分分析(PCA)是一种无监督分析方法，可被用于降低复杂数据集中的维数，同时在10个主成分(PC)中捕获大部分生化信息[14]。线性判别分析(LDA)使组间方差最大化，同时使组内方差最小化[15]，结果以得分图和载荷图呈现。得分图通过组间距离直观地显示处理组和对照组之间的差异；而载荷图可识别与化学物质引起的生物大分子变化相关的红外波数。对聚类矢量图中最突出的5个波数进行重点分析，以识别主要生化水平的变化。
本研究采用生物红外光谱与多元统计分析相结合的方法，从生化水平进一步探讨3种常用消毒剂(NaClO、H2O2和UV辐射)的消毒机理，以快速评价其消毒效果。选取2种具有代表性的细菌(革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichia coli，简称E.coli)和革兰氏阳性海氏肠球菌(Enterococcus hirae，简称E.hirae)作为受试菌种，获得其生化信息，并对其进行处理，以反映消毒后生物分子的变化。本研究有助于更好地理解消毒剂的消毒机理，更快速地对消毒效果进行评价，有助于优化消毒工艺，更好地保障用水安全。
1. 研究方法
1.1 细胞培养
革兰氏阴性菌E.coli (ATCC 8099)和革兰氏阳性菌E.hirae (ATCC 8043)从广东省菌种采集中心获得，在Mueller-Hinton (MH)肉汤培养基中培养，温度37 ℃，转速150 r/min。将实验用的细菌培养过夜，离心5 min (4 ℃，5 000 r/min)，然后用磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH 7.4)悬浮。
1.2 消毒剂
有效氯约为4.00%~4.99%的NaClO购自Sigma Chemical Co.(St.Louis, MO)并储存于4 ℃。配制原液，并用余氯分析仪(pocket colorimeter TM II) (Hach Co.)测定HClO浓度。H2O2溶液(~30%)购自广州化学试剂厂。用超纯水配制H2O2原液，并用高锰酸钾滴定法测定其浓度。紫外辐射由紫外灯产生，波长集中在254 nm，辐射强度由紫外辐照计(Sentry Optronics Co.)测量。
1.3 中和剂鉴定试验
为了在实验结束时对残留的消毒剂进行有效中和，停止其与微生物继续反应，需要在灭菌试验之前进行中和剂鉴定试验，以选择合适的中和剂。本试验共设8组：(1)消毒剂+细菌悬浮液，检测消毒效果；(2)(消毒剂+细菌悬浮液)+中和剂，检测残留消毒剂中和时的细菌回收能力；(3)中和剂+细菌悬浮液，检测中和剂的灭活情况；(4)(消毒剂+中和剂)+细菌悬浮液，进行中和后产品的灭活试验；(5)参照对照，用PBS代替消毒剂；(6)只使用PBS，确保PBS无菌；(7)只使用中和剂，确保中和剂无菌；(8)介质控制。选择合适的中和剂已符合以下要求：第6、7、8组无菌，第3、4、5组的细菌数量相近，误差率可控制在10%以内，第2组的细菌数量多于第1组，但少于3、4、5组。
1.4 消毒试验
消毒试验在超净工作台(SW-CJ-3FD，苏州安泰爱尔科技有限公司)上进行，温度控制在(20±1)℃。在2 mL试管体系内进行消毒反应，细菌数量保持在1×107~5×108 CFU/mL。实验前配制消毒剂浓度，用PBS稀释。向每支容积为2 mL的试管中加入20 μL的细菌悬浮液，转移至不同浓度的消毒剂(180 μL)中混匀。在规定的时间，取上述混合液100 μL加入试管中，每支试管中预先加入1.9 mL中和剂。10 min后收集细菌样本，用于菌落平板计数和FTIR分析。
紫外线消毒试验在清洁工作台的水平紫外线灯下进行。将6孔板置于适当位置，每孔板含5 mL细菌悬浮液，紫外的辐射强度为100 mJ/cm2。紫外灭菌前，应将紫外灯提前20 min打开以稳定辐射强度。当辐射暴露实验完成后，立即用锡纸覆盖细菌悬浮液，防止进一步的紫外线辐射。然后采集细菌样本进行后续分析。细菌计数公式为:
细菌对数杀灭率=lg(N0/Nt),化学消毒剂剂量=Ct,UV剂量=kt, 其中，N0为未处理细菌数量，Nt为处理后细菌数量，C为NaClO或H2O2浓度，t为暴露时间，k为UV辐射强度。
1.5 细菌灭活分析
用平板计数法测定抑菌活性。将细菌悬浮液用PBS溶液依次稀释，用移液器取0.1 mL菌悬液滴在营养琼脂平板上涂抹均匀。将细菌在恒温培养箱(37 ℃)的一次性培养皿中培养24 h后，用平板菌落计数法测定细菌生长情况。此外，在细菌灭活处理后，取0.1 mL菌悬液，离心5 min (5 867 g，4 ℃)，采用PBS洗涤，用质量分数为10%的中性福尔马林溶液固定。最后用傅立叶变换红外光谱仪检测细菌的生物学效应。
1.6 FTIR光谱分析
对固定后的细菌悬液采用超纯水冲洗3次并离心，用100 μL超纯水重悬，用移液器转移2 μL于BaF2载玻片上，然后在干燥器中干燥12 h。使用Bruker Vertex 70 FTIR光谱仪(Bruker Optics)进行红外光谱测试。每张载玻片共获得25张光谱图，每个处理包含3个平行实验。光谱采集分辨率为4 cm-1，扫描次数达64次。在生化指纹区(1 800~900 cm-1)获取原始细菌光谱数据，经基线校正后将光谱信息归一化至酰胺I (1 650 cm-1)。随后，使用MATLAB r2010a中的IRootLab[16]对数据集进行主成分分析-线性判别分析(Principal Component Analysis-Linear Discriminant Analysis, PCA-LDA)。结果包含2种信息：(1)实验组与对照组之间的差异大小; (2)实验组与对照组之间的差异波数。
1.7 数据分析
用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnett's检验(Dunnett's post-hoc tests)分析LD1空间得分的统计学差异。采用S型剂量-反应法对非线性曲线进行拟合分析。所有统计分析在GraphPad Prism 4软件(GraphPad software Inc., USA)中进行。
2. 结果与讨论
2.1 细菌失活动力学
3种试验消毒剂的灭活曲线如图 1所示。细菌对数杀灭率与暴露剂量呈显著正相关关系(P＜0.05)，符合S型曲线。对于E.coli，NaClO、H2O2和UV分别在89.60 min ·mg/L、75.18 min ·g/L和41.32 min ·mJ/cm2时的对数杀灭率为2。在E.hirae中，NaClO、H2O2和UV暴露剂量分别为91.11 min ·mg/L、95.84 min ·g/L和126.68 min ·mJ/cm2时可获得对数杀灭率为2的灭活效果。
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图 1 NaClO、H2O2和UV对E.coli和E.hirae的暴露剂量-对数杀灭关系Figure 1. The antimicrobial activity of NaClO, H2O2 and UV on E.coli and E.hirae由实验所得对数杀灭率可知，这三类消毒剂中，NaClO对2种细菌均表现出较好的杀灭效果；H2O2处理对E.coli的失活能力大于对E.hirae的失活能力，在300 min ·g/L的质量浓度下，其对数杀灭率仅为2.3；紫外光处理对E.coli的失活能力也大于对E.hirae的失活能力。受试消毒剂均有灭活能力，但NaClO组的杀菌效果最好。对比研究2种细菌发现，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对消毒剂表现出更强的抗性。
2.2 生物变化
对于E.coli，LD1得分图显示了消毒剂杀灭组与对照组之间的差异(图 2)。在用NaClO处理的E.coli中，生化信息变化效应是非线性的，并且随着暴露剂量的增加而增加。NaClO引起的生物变化主要与酰胺II(1 543 cm-1)的C—N键伸缩振动和N—H键弯曲振动、酰胺I(1 624 cm-1)的C＝O伸缩振动、糖原(1 030 cm-1)的C—O键伸缩振动、DNA/RNA(1 084 cm-1)的对称磷酸伸缩振动以及脂质(1 747 cm-1)的C＝O伸缩振动相关(表 1)。在H2O2处理的细胞中，也存在剂量-效应关系。主要的生化信息变化与酰胺II(1 543 cm-1)、酰胺I(1 608 cm-1)、脂质(1 724 cm-1)和糖原(1 018 cm-1)有关。对于暴露在紫外线下的细胞，基于生物大分子变化的影响也随暴露剂量的增加而增加，主要振动发生在酰胺I(1 651、1 597 cm-1)、蛋白质磷酸化(987 cm-1)、糖原(1 107 cm-1)和DNA/RNA的不对称磷酸伸缩振动(1 230 cm-1)。
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图 2 不同剂量消毒剂处理E.coli的红外光谱分析Figure 2. The analysis of FTIR spectra from E.coli treated with increasing doses of disinfectants表 1 不同剂量消毒剂处理的E.coli和E.hirae的前5个峰的峰指认Table 1. The peak assignments for the top five peaks from the loadings plots for E.coli and E.hirae treated with different doses of disinfectants消毒剂 E.coli E.hirae 波长/cm-1 特征峰识别 波长/cm-1 特征峰识别 NaClO 1 543 酰胺II 1 624 酰胺I NaClO 1 624 酰胺I 1 061 C—C骨架 NaClO 1 030 C—O伸缩振动 995 RNA NaClO 1 084 对称磷酸伸缩振动 1 161 C—OH伸缩振动 NaClO 1 747 脂质 1 658 酰胺I H2O2 1 543 酰胺II 999 糖原 H2O2 1 608 酰胺I 1 624 酰胺I H2O2 1 670 酰胺I 1 246 非对称磷酸伸缩振动 H2O2 1 724 脂质 1 064 C—O伸缩振动 H2O2 1 018 糖原 1 523 酰胺II UV 1 651 酰胺I 1 662 酰胺I UV 987 蛋白质磷酸化 1 701 脂质 UV 1 597 酰胺I 1 520 酰胺II UV 1 107 糖原 1 215 非对称磷酸伸缩振动 UV 1 230 非对称磷酸伸缩振动 1 030 糖原 如图 3、表 1所示，当E.hirae暴露在NaClO中，随着暴露剂量的增加，存在明显的剂量效应关系，主要的生物学变化与酰胺I(1 624、1 658 cm-1)、糖原(1 061 cm-1)、RNA(995 cm-1) 以及碳水化合物(1 161 cm-1)相关。H2O2处理的细胞主要振动与糖原(999、1 064 cm-1)、酰胺I(1 624 cm-1)、DNA/RNA(1 246 cm-1)和酰胺II(1 523 cm-1)有关。对于暴露在紫外线辐射下的E.hirae，其生物大分子的变化情况与E.coli暴露组不同。从两者暴露于紫外线的EC50可以看出，革兰氏阴性菌(EC50=0.58)比革兰氏阳性菌(EC50=48.3)对紫外线更敏感，且两者在紫外线诱导下的主要生物改变也有所不同。如表 1所示，对于E.hirae，紫外线引起的主要振动与酰胺I(1 662 cm-1)、脂质(1 701 cm-1)、酰胺II(1 520 cm-1)、DNA/RNA(1 215 cm-1)和糖原(1 030 cm-1)有关。
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图 3 不同剂量消毒剂处理的E.hirae的红外光谱分析Figure 3. The analysis of FTIR spectra from E.hirae treated with increasing doses of disinfectants2.3 不同消毒剂介导生化信息变化的比较
为了确定3种消毒剂引起的生物变化差异，在对暴露的细菌分别进行2-log失活测试后，获得了另一个数据集。如图 4的评分图所示，在LD1和LD2上观察到处理组和对照组之间的明显分离。不同消毒剂处理组在评分图上的距离代表不同的效应变化。由于在E.coli中用不同的消毒剂处理细胞，当细胞减少为2-log时，处理后的细胞与对照组之间的距离相似，表明基于生化信息的影响具有可比性。这些差异主要表现为酰胺Ⅱ(1 585、1 539 cm-1)、酰胺I(1 655 cm-1)、脂质(1 701、1 739 cm-1)、氨基酸残留(1 408 cm-1)和蛋白磷酸化(933 cm-1)。对于E.hirae，不同处理组和对照组之间的评分图中距离的变化更大。沿LD1方向的不同距离从大到小顺序：NaClO、H2O2、UV(图 4B)，说明消毒剂有不同的灭活能力。主要的生物变化与酰胺I(1 628 cm-1)、糖原(999、1 064 cm-1)、碳水化合物(1 118 cm-1)、酰胺III(1 180 cm-1)、DNA/RNA (1 230 cm-1)和蛋白质(1 458 cm-1)有关。结果表明：NaClO比H2O2和UV暴露引起的生物变化更大。
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图 4 E.coli和E.hirae 2-log灭活状态下的红外光谱PCA-LDA得分图和聚类向量图Figure 4. The PCA-LDA scores plots and cluster vectors of FTIR spectra obtained from E.coli and E.hirae at the 2-log inactivation如图 5所示，对数失活和由3种不同消毒剂引起的2种不同细菌的生物变化之间明显关联。在NaClO处理后，E.coli (R2>0.9)和E.hirae (R2>0.8)的对数失活与生物变化关系可以用线性模型拟合，而在H2O2或UV处理后，用二次函数(R2>0.8)拟合对数失活与生物变化的关系更合适。
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图 5 消毒能力与生物变化的回归分析Figure 5. The correlation analysis between the disinfection capacity and the biological alterations2.4 消毒效果分析
本研究表明3种消毒剂的细菌灭活能力不同，并得出了个体的生物大分子变化概况。总的来说，NaClO的消毒效率最高，其次是H2O2和UV。3种消毒剂对革兰氏阴性菌的消毒效果均优于对革兰氏阳性菌的消毒效果。细菌灭活与生物大分子变化信息之间的良好关联意味着基于FTIR光谱技术可用于快速评估消毒剂的消毒能力。
用NaClO处理不同的细菌可获得相似的失活效果，但其生物大分子水平的变化情况不同。在革兰氏阴性菌中，它主要影响蛋白质二级结构的β-转角，β-转角含量的增加会导致蛋白质结构稳定性的降低。研究表明，β-转角结构与酶活性和功能密切相关[17-18]。NaClO暴露可影响DNA的合成[19]，A1030/A1080的降低也表明其对DNA的损伤作用。此外，作为膜损伤的第一步，脂质过氧化可能导致膜通透性和流动性的变化[20-22]，这与本文观察到的脂质C＝O的振动一致。在革兰氏阳性菌中，被归因于蛋白质乙酰化的A1624/A1658的降低[23-24]，可能与酶活性和蛋白质之间的相互作用有关，导致糖酵解过程中酶活性降低[25]。这与NaClO处理后碳水化合物振动和细胞ATP耗竭相一致[19]。此外，RNA相关振动的减少表明生物效应与核酸的合成有关[26]。研究表明ClO-不仅能与外膜反应，而且能穿透细胞攻击大分子，导致膜脂质过氧化、改变膜透性和细胞内物质释放、ATP耗竭、酶的结构和功能的变化以及核酸的合成[20, 27]。BAKER等[28]系统地研究了NaClO与蛋白质的反应，结果表明：氯化和氧化同时发生，导致蛋白质中氨基酸和氨基酸残基的断裂，以及蛋白质中肽键以外的基团断裂。也有研究发现，当蛋白质与稀释的NaClO孵育时，蛋白质会变成碎片[29-30]。本研究进一步表明，暴露于NaClO的细菌会导致膜脂质结构的改变和过氧化，进而可能引起蛋白质二级结构的改变，并对DNA和其他细胞间物质造成损伤。
经过H2O2处理后，2种细菌的失活能力明显不同(图 1)。对于革兰氏阴性菌，其基本的生物学机制包括A1608/A1670的降低，这归因于蛋白质二级结构的β-转角和β-折叠。β-折叠和β-转角在蛋白质稳定性和分子识别中起着重要作用[31]。它还诱导了脂质变化，这与膜脂质结构、磷脂双分子层的流动性和通透性相关[27, 32]。在革兰氏阳性菌中，H2O2处理后的生物学机制主要与能量代谢振动、蛋白质β-转角结构以及DNA/RNA损伤有关。H2O2作为最强的氧化剂，很容易打破E.coli的细胞壁保护屏障，与蛋白质、膜脂质等细胞间物质相互作用，破坏酶和功能蛋白，改变能量代谢[33]。E.hirae的细胞壁保护屏障更强[17]，H2O2光解产生的自由基主要与大分子反应，破坏细胞壁上的交联网状结构，然后进入细胞内环境诱导抗氧化反应，并产生ROS氧化蛋白和脂质[34]。
由于不同的生物学机制，紫外线辐射对革兰氏阴性菌比对革兰氏阳性菌具有更好的失活能力[35]。对于革兰氏阴性菌，紫外线照射引起的主要变化与蛋白质二级结构α-螺旋的减少有关，这可能导致蛋白质结构的松动[36]。紫外线照射还会导致蛋白质磷酸化的变化，这可能会影响蛋白质的活性和功能[37]，并导致信号转导受阻，从而影响细胞生长[38]。本研究观察到的红外振动中也观察到核酸的改变，其他研究中表明的对DNA合成的影响为这一现象提供了有力支持[32, 39]。然而，对于革兰氏阳性菌，紫外线处理的重要影响是β-折叠含量增加和脂质减少，同时还观察到核酸和能量代谢的改变。因此，紫外线辐射的主要机制被认为是对核酸的损伤、蛋白质、脂质和其他细胞间物质的改变[36, 40]。
3. 结论
采用红外光谱和化学计量学相结合的方法，探讨了3种消毒剂的生物效应。研究结果为分子水平上的消毒机制提供了新的见解。主要得出以下结论：
(1) 经不同消毒剂处理后，革兰氏阴性E.coli和革兰氏阳性E.hirae都有明显的改变，且革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌更易受消毒剂的影响。
(2) NaClO、H2O2以及紫外线消毒3类消毒剂中，NaClO对2种细菌均表现出较好的杀灭效果；而H2O2处理以及紫外线处理对E.coli的失活能力均大于对E.hirae的失活能力。
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图 1 NaClO、H2O2和UV对E.coli和E.hirae的暴露剂量-对数杀灭关系
Figure 1. The antimicrobial activity of NaClO, H2O2 and UV on E.coli and E.hirae
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图 2 不同剂量消毒剂处理E.coli的红外光谱分析
Figure 2. The analysis of FTIR spectra from E.coli treated with increasing doses of disinfectants
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图 3 不同剂量消毒剂处理的E.hirae的红外光谱分析
Figure 3. The analysis of FTIR spectra from E.hirae treated with increasing doses of disinfectants
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图 4 E.coli和E.hirae 2-log灭活状态下的红外光谱PCA-LDA得分图和聚类向量图
Figure 4. The PCA-LDA scores plots and cluster vectors of FTIR spectra obtained from E.coli and E.hirae at the 2-log inactivation
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图 5 消毒能力与生物变化的回归分析
Figure 5. The correlation analysis between the disinfection capacity and the biological alterations
表 1 不同剂量消毒剂处理的E.coli和E.hirae的前5个峰的峰指认
Table 1 The peak assignments for the top five peaks from the loadings plots for E.coli and E.hirae treated with different doses of disinfectants
消毒剂 E.coli E.hirae 波长/cm-1 特征峰识别 波长/cm-1 特征峰识别 NaClO 1 543 酰胺II 1 624 酰胺I NaClO 1 624 酰胺I 1 061 C—C骨架 NaClO 1 030 C—O伸缩振动 995 RNA NaClO 1 084 对称磷酸伸缩振动 1 161 C—OH伸缩振动 NaClO 1 747 脂质 1 658 酰胺I H2O2 1 543 酰胺II 999 糖原 H2O2 1 608 酰胺I 1 624 酰胺I H2O2 1 670 酰胺I 1 246 非对称磷酸伸缩振动 H2O2 1 724 脂质 1 064 C—O伸缩振动 H2O2 1 018 糖原 1 523 酰胺II UV 1 651 酰胺I 1 662 酰胺I UV 987 蛋白质磷酸化 1 701 脂质 UV 1 597 酰胺I 1 520 酰胺II UV 1 107 糖原 1 215 非对称磷酸伸缩振动 UV 1 230 非对称磷酸伸缩振动 1 030 糖原 
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