The Preparation of Arb-BSA-NP Nanoparticals and Their Application to Burn Injury Repair
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摘要: 通过以牛血清白蛋白V(BSA)为载体，去溶剂化法制备熊果苷纳米粒(Arb-BSA-NP)，研究其对大鼠烧伤修复的效果. 利用粒径分布和Zeta电位对纳米粒进行表征，结果显示：熊果苷与白蛋白比例1 ∶ 10、pH7.0的条件下用戊二醛交联12 h，粒子大小均一且稳定性较好，平均粒径为175.26±11.04 nm，Zeta电位为-29.12±0.80 mV；将细菌纤维素膜浸渍于含Arb-BSA-NP纳米粒溶液中获得负载熊果苷纳米粒的纤维膜敷料(Arb-BSA-BC)，并对该材料进行SEM分析，显示Arb-BSA-NP纳米颗粒分布在材料表面；通过SD大鼠烧伤模型动物实验评价该敷料对烧伤创面愈合的效果，结果显示负载熊果苷纳米粒的纤维膜敷料有助于烧伤创面的恢复和愈合.Abstract: Bovine serum albumin V(BSA) was used as the carrier to prepare arbutin(Arb)-loaded nanoparticles (Arb-BSA-NP)with the desolvation method and the curative effect of Arb-BSA-NP on rat burn injury was studied. The particle size distribution and Zeta potential analysis were performed to characterize Arb-BSA-NP, and the results showed that the average particle size of Arb-BSA-NP was 175.26±11.04 nm and the average Zeta potential was -29.12±0.80 mV, which suggested that Arb-BSA-NP had a uniform particle size and good stability after 12 h of glutaraldehyde crosslinking under the conditions of pH7.0 and the ratio of arbutin to albumin was 1 : 10. Cellulose membrane was then immersed into the solution containing Arb-BSA-NPs, and the nanoparticles were precipitated onto the surface to form Arb-BSA-BC, which were manifested with the SEM analysis. The curative effect of Arb-BSA-BC on rat burn injury was attested with the burn repair experiment. It was proved that Arb-BSA-BC contributed to the repair and healing of burn injury.
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Keywords:
- arbutin /
- Arb-BSA-NP /
- burn injury
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熊果苷是广泛存在于蔷薇花科、杜鹃花科等植物中的一种酚性葡萄糖苷, 熊果苷分子式为C12H1607，相对分子质量为272.25，有α-熊果苷和β-熊果苷2种差向异构体，外观为无色至白色粉末，熔点约在195~198 ℃，20 ℃下溶解度为100~150 g/L，易溶于热水、甲醇、乙醇等的水溶液，不溶于乙醚、氯仿和石油醚等[1]. 熊果苷分子中具有2种结构性功能基团，即葡萄糖残基和酚基. 葡萄糖残基有亲水性，酚基有黑色素合成酶抑制作用，故其可以在一定程度上起到保湿美白的作用，可作为美白剂添加至美白类化妆品中起到美白功效[2-3]. 除此之外，熊果苷具有快速止痛、消炎力强等特点，可以作为新型烫伤药[4]. 但熊果苷存在遇光不稳定、对pH值敏感、难以在皮肤滞留和吸收等问题而限制其应用[5].
皮肤烧伤治疗中，传统方法往往采取早期切痂植皮或先用磺胺嘧啶银治疗，再进行植皮治疗，该方法存在皮源困难、愈合瘫痕增生和功能障碍等缺陷[6]. 细菌纤维素膜(Bacterial Cellulose Membrane) 具有良好的力学性能、高持水性和组织相容性等优点，在组织工程支架和人工皮肤等方面具有广泛的应用前景，是目前生物医用材料研究的热点领域[7-8]. 本研究将熊果苷通过白蛋白纳米粒负载于细菌纤维素膜上，用于尝试烧伤皮肤的修复，旨在开发含熊果苷的新型高效皮肤组织修复材料，控制药物释放，用于烧伤皮肤修复，改善传统治疗皮肤烧伤的修复效果.
1. 材料与方法
1.1 主要材料
熊果苷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，牛血清白蛋白(北京索莱宝科技有限公司)，细菌纤维素膜(海南光宇生物科技有限公司)，HE染色试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)，纳米粒度和Zeta电位仪(Nano Series，Malvern Instruments Ltd.)，石蜡包埋机(EG1150，LEICA)，切片机(RM2235，LEICA)，扫描电子显微镜(Quanta 200，FEI)
SPF级成年健康3月龄SD大鼠，雌雄不限，体质量200~250 g，购于南方医科大学实验动物中心，合格证号SCXK(粤)2016-0041. 普通级动物房饲养，动物处置参照《关于善待实验动物的指导性意见》进行.
1.2 方法
1.2.1 Arb-BSA-NP的制备及检测分析
采用去溶剂法制备熊果苷纳米粒子(Arb-BSA-NP)[9]，具体操作如下：熊果苷(Arbutin, Arb)和白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)溶于纯水，在磁力搅拌器上边搅拌边滴加乙醇至溶液乳化，然后添加戊二醛溶液进行交联，交联完成后减压蒸馏除去乙醇，即为Arb-BSA-NP. 对pH、交联时间、熊果苷与白蛋白的比例等3个因素进行优化，取Arb-BSA-NP乳悬液适量，用纳米粒度和Zeta电位仪分别测定其粒径分布和电位，数据利用SPSS进行分析.
1.2.2 负载熊果苷纳米粒(Arb-BSA-BC)的SEM分析
所制备的Arb-BSA-NP溶于缓冲溶液中，将纤维素膜浸渍其中过夜, 收集负载Arb-BSA-NP纳米粒的细菌纤维素膜，该膜命名为Arb-BSA-BC，对Arb-BSA-BC进行扫描电镜分析.
1.2.3 Arb-BSA-BC用于治疗大鼠烧伤实验
(1) 烧伤模型的建立. 采用膏状固体酒精灼烧法[10]制备烧伤模型，实验动物12只，体质量200~250 g，1.4%戊巴比妥钠(注射剂量105 mg/kg，按体质量计)腹腔注射麻醉后，于背部脊柱涂抹膏状固体酒精2 cm×2 cm，灼烧30 s，生理盐水擦拭干净创面. 手术过程如图 1所示.
(2) 烧伤修复实验. 随机各取烧伤大鼠3只，创面分别覆盖熊果苷纳米纤维素膜Arb-BSA-BC、细菌纤维素膜(BC)、凡士林油纱(传统敷料组)和无处理(模型对照组)，均以无菌纱布覆盖透气胶布固定包扎，隔天换药，观察其创面愈合情况.
(3) 病理切片. 大鼠在烧伤16 d后处死，取烧伤区域皮肤做石蜡病理切片. 切片于4%PBS-多聚甲醛固定24 h. 经70%乙醇2.0 h、80%乙醇2.0 h、90%乙醇1.5 h、95%乙醇(2次，每次1.0 h)、无水乙醇1.0 h脱水、无水乙醇0.5 h脱水、二甲苯(2次，每次45 min)，透明后，石蜡(2次，每次1.0 h)后包埋. 转换不同种试剂之间，按V(前置试剂)比V(后置试剂)2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2分别浸泡15 min逐步过渡. 病理切片苏木素伊红染色后镜检.
2. 实验结果与分析
2.1 Arb-BSA-NP制备的优化
2.1.1 不同投料比对熊果苷纳米粒粒径及Zeta电位的影响
投料比对纳米粒子的粒径及稳定性有较大的影响，在其他条件相同的情况下，以投料比(m(熊果苷) ∶ m(牛血清白蛋白))为1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 12分别制备熊果苷纳米粒，其粒径分布及Zeta电位见图 2. 从图 2中可以看出：投料比1 ∶ 10组的平均Zeta电位与其余2组的差异具有统计学意义(P < 0.01)，平均粒径均一，主要集中在200 nm附近，Zeta电位显示其稳定性也明显优于其他组，能减少粒子之间的凝聚，形成稳定的混悬液.
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图 2 不同投料比对熊果苷纳米粒粒径及Zeta电位分布的影响Figure 2. The effects of different ratios of arbutin to albumin on Arb-BSA-NP size and Zeta potential2.1.2 不同pH对熊果苷纳米粒粒径及Zeta电位的影响
熊果苷在酸性条件下易分解，在中性和弱碱性下稳定性较好，因而分别在pH 7.0和pH 8.0制备Arb-BSA-NP，其粒径分布及Zeta电位见图 3. 在pH为7.0、8.0时(图 3)，制备的Arb-BSA-NP的平均粒径分别为200.48±4.43、730.38±16.49 nm，差异具有统计学意义(P < 0.01)；Zeta电位分别为-26.132±1.473、-37.13±1.79 mV，差异具有统计学意义(P < 0.01). 这可能与牛血清蛋白的性质有关，天然牛血清白蛋白的等电点为4.6~5.8，在本实验制备条件下蛋白质带负电, pH增加可能引起液滴絮凝或联合[11]，并且戊二醛的反应速度随pH增加交联效果加强[12]，引起粒子之间相互结合，形成大小不一的粒子，因而pH 8.0粒子粒径较大，均一性较差；pH升高导致粒子携带更多负电荷，从而其Zeta电位更低，稳定性提高. 综合粒径与Zeta电位两方面考虑pH为7.0.
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图 3 不同pH对熊果苷纳米粒粒径及Zeta电位分布的影响Figure 3. The effects of different pH values on Arb-BSA-NP particle size and zeta potential2.1.3 不同交联时间对熊果苷纳米粒粒径及Zeta电位的影响
在最佳投料比1 ∶ 10及pH为7.0条件下，分别利用25%戊二醛交联6、12、16 h制备熊果苷纳米粒，其粒径分布及Zeta电位见图 4. 从图 4中可以看出：交联时间为6、12、16 h，纳米粒平均粒径分别为200.48±4.43、175.26±11.04、532.46±79.95 nm，平均Zeta电位分别为-26.13±1.47、-29.12±0.80、-25.07±1.70 mV；交联时间为12 h与16 h的平均粒径与Zeta电位的差异具有统计学意义(P < 0.01)，6 h与12 h之间的差异不具有统计学意义. 可见交联时间为12 h所制备的Arb-BSA-NP粒径小，稳定性高.
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图 4 不同交联时间对熊果苷纳米粒粒径及Zeta电位分布的影响Figure 4. The effects of different cross-linkage time lengths on Arb-BSA-NP size and Zeta potential综合上述优化实验结果，确定熊果苷纳米粒制备条件为：投料比1 ∶ 10，pH为7.0，交联时间为12 h，在该条件下制备所得的熊果苷纳米粒平均粒径为175.26 nm，Zeta点位为-29.12 mV.
2.2 Arb-BSA-BC扫描分析
所制备的Arb-BSA-BC的电镜扫描分析结果见图 5，可见膜表面有颗粒聚集，而在空白纤维素膜表面无颗粒聚集，而加入粒子后，在纤维膜表面就有Arb-BSA-NP纳米粒沉降.
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图 5 负载Arb-BSA-NP的细菌纤维素和无负载纳米粒细菌纤维素的SEM分析Figure 5. The SEM analysis of cellulose loaded with Arb-BSA-NP and cellulose with no precipitation of nanoparticals2.3 大鼠烧伤修复实验结果
2.3.1 烧伤创面愈合情况
对所制备的Arb-BSA-BC用于烧伤大鼠的创面治疗，其结果如图 6所示.
烧伤4 d后，4组创面均由渗出物干燥形成干痂，开始覆盖创面治疗，进行痂下愈合；烧伤后8 d，部分痂皮开始出现松动，剪去部分松动的干痂后，可见创面仍在愈合之中，基底呈白色、红色，伤口持续向外分泌渗出物；烧伤后12 d，模型对照组的干痂开始出现松动，传统敷料组痂皮掉落，但伤口未完全愈合，新的渗出物干燥形成新的干痂，Arb-BSA-BC组的干痂已脱落，创面逐步愈合，渗出明显减少；烧伤后16 d，各组创面基本愈合，新生上皮组织呈粉红色. 空白组、传统敷料组、BC组有轻微红肿. 但Arb-BSA-BC组已完全愈合，表面已有新生毛皮覆盖，表明Arb-BSA-BC对该烧伤创面治愈效果良好. Arb-BSA-BC组相比其他组，其脱痂时间更早，且创面红肿较轻. 这可能与熊果苷具有抗炎作用，能抑制烧伤过程中炎症因子有关[13].
2.3.2 愈合创面组织切片观察
对愈合创面进行组织切片和HE染色，其结果如图 7所示. 根据创面的外表观察以及病理组织切片显示，皮肤附属物被完全破坏，炎症细胞浸润少见，真皮结缔组织增生加厚. 其中模型对照组表皮凹凸不平，角化不完全；传统敷料组创面周围恢复较好，但创伤中心区仍有少量表皮尚未修复，表皮组织持续向创面中央生长；BC及Arb-BSA-BC较传统敷料能加速伤口干痂脱落，BC组及Arb-BSA-BC组创面已经填平，伤口中央区表皮连续，周围表皮再生完全. Arb-BSA-BC组较普通BC组，脱痂速度更快，12 d时就已完成脱痂，且伤口基本恢复，创面的红肿较少. 表明细菌纤维素的纤维网状结构具备了负载药物增强治疗效果的能力，由此可见，本研究合成的负载熊果苷纳米粒的细菌纤维素敷料具有促进烧伤创面愈合的功效.
3. 讨论
熊果苷是一种天然存在的糖苷类物质, 随着近年来研究的不断深入, 证实熊果苷有多种药理作用，如抗菌、镇咳、平喘、祛痰、抗氧化、利尿、抗溃疡、抗肿瘤、抑制胰岛素降解、增强免疫等效用[14]. 细菌纤维素具有高纯度和高结晶度、很强的持水能力、较高的生物相容性和生物可降解性而在材料行业备受关注[15]. 本研究以细菌纤维素为材料，负载具有抗炎性能的熊果苷纳米粒，开发一种新型的烧伤创面修复材料Arb-BSA-BC. 烧伤动物实验表明，纤维素膜疏松多孔的结构以及纤维素中的羟基等亲水基团能吸附大量的水分，保水率高达88%以上，其含有的大量水分能够营造湿润的环境，能加速伤口干痂的脱落速度，促进愈合. 相对于传统敷料组来说，Arb-BSA-BC材料和细菌纤维素处理后，干痂脱落早，创面愈合快，渗出明显减少，但Arb-BSA-BC组相比细菌纤维素组来说，其脱痂时间更早，且创面红肿较轻. 这可能与熊果苷具有抗炎作用，能抑制烧伤过程中炎症因子有关. 可见，通过纤维素膜负载熊果苷纳米粒进行烧伤治疗，可改善传统敷料治疗皮肤烧伤治疗中的修复效果，可以解决皮肤修复过程中的感染问题，为解决皮肤烧伤问题提供新的皮肤组织工程材料和治疗新思路
总之，目前研究取得初步成果，还需针对以下问题做深入研究，以完善该材料的使用：(1)熊果苷纳米粒的包封率及载药量；(2)细菌纤维素膜负载纳米粒的效率和机制；(3)负载熊果苷纳米粒的纤维膜在烧伤治疗中的最佳浓度、在创面的释放效果、释放方式，以及药物吸收率、安全性等问题仍未完全明晰.
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图 2 不同投料比对熊果苷纳米粒粒径及Zeta电位分布的影响
Figure 2. The effects of different ratios of arbutin to albumin on Arb-BSA-NP size and Zeta potential
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图 3 不同pH对熊果苷纳米粒粒径及Zeta电位分布的影响
Figure 3. The effects of different pH values on Arb-BSA-NP particle size and zeta potential
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图 4 不同交联时间对熊果苷纳米粒粒径及Zeta电位分布的影响
Figure 4. The effects of different cross-linkage time lengths on Arb-BSA-NP size and Zeta potential
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图 5 负载Arb-BSA-NP的细菌纤维素和无负载纳米粒细菌纤维素的SEM分析
Figure 5. The SEM analysis of cellulose loaded with Arb-BSA-NP and cellulose with no precipitation of nanoparticals
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