The Effect of Nardosinone on Hypoxic Injury of H9C2 Cardiomyocytes and Its Mechanism
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摘要: 以氯化钴(CoCl2)构建H9C2心肌细胞低氧损伤模型,研究Nar在其中的作用及机制. CCK-8试剂盒检测细胞活力,流式细胞仪测细胞凋亡,以自噬抑制剂3-MA预作用细胞探讨Nar对自噬的影响,Western Blot检测Beclin-1、LC3II/LC3I、P62、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达,分光光度计测定乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和肌酸激酶(CK)含量. 结果显示:CoCl2 (500 μmol/L)可抑制约50 %细胞生长,而Nar (50 μmol/L)预处理显著减轻了CoCl2 (500 μmol/L)诱导的细胞凋亡;另外,Nar通过增加LC3II/LC3I和Beclin-1表达及促进P62降解激活了自噬,但3-MA预作用逆转了该过程;3-MA预作用同时逆转了Nar对CoCl2造成的H9C2细胞凋亡和氧化损伤的保护作用. 研究表明:Nar在心肌细胞低氧损伤中以诱导自噬抑制凋亡的方式保护心肌细胞,Nar可能成为治疗低氧性心脏病的潜在药物.Abstract: The model of hypoxic injury of H9C2 cardiomyocytes was established with cobalt chloride (CoCl2) to study the role of Nardosinone (Nar) in it and its mechanism. CCK-8 kit was used to detect cell viability and flow cytometry was used to detect apoptosis. Autophagy inhibitor 3-MA was used to pretreat cells to evaluate the effect of Nar on autophagy. The expressions of Beclin-1, LC3II/LC3I, P62, Bax, Bcl-2 and Caspase-3 were detected with Western Blot, and the contents of lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and creatine kinase (CK) were measured with spectrophotometer. The results showed that CoCl2(500 μmol/L) inhibited the growth of H9C2 cells by about 50% while the pretreatment with Nar(50 μmol/L) significantly alleviated CoCl2-induced cell apoptosis. In addition, Nar promoted P62 degradation and increased the expressions of LC3II/LC3I and Beclin-1, which were reversed with 3-MA pretreatment. At the same time, pretreatment with 3-MA reversed the protective effects of Nar on CoCl2-caused H9C2 cell apoptosis and oxidative damage. The results showed that Nar played a protective role in myocardial hypoxic injury by inducing autophagy and inhibiting apoptosis. It was suggested that Nar may be a potential drug for the treatment of hypoxic heart disease.
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Keywords:
- nardosinone /
- autophagy /
- apoptosis /
- cardiomyocytes /
- hypoxia /
- oxidative damage
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缺血性心脏病(ischemic heart disease, IHD)已成为世界上死亡率较高疾病之一,主要是由冠状动脉狭窄致心肌缺血引起的[1]. 而心肌缺血造成的氧含量降低是IHD发病的重要原因之一. 虽有研究表明急性低氧能提高细胞存活率,促进细胞对低氧环境的适应,但慢性或极端低氧却引起细胞死亡. 同时,心肌低氧常常伴有氧自由基增加、钙超载、细胞凋亡和炎症反应等现象. 因此,保护心肌细胞免受低氧损伤是降低IHD风险的有效策略.
自噬是一个复杂的细胞分解代谢过程[2]. 通常自噬可以保护细胞免受各种破坏性因素的影响,如低氧或饥饿,以维持细胞内稳态[3]. 同时,自噬对于维持心脏正常功能至关重要[4]. 在缺血应激下,自噬被激活以保护心肌细胞免受缺血或缺血/再灌注损伤[5]. 而严重缺血时,心脏过度自噬会促进细胞死亡并恶化心脏功能[6].
甘松新酮(Nardosinone,Nar)是一种从甘松提取而来的倍半萜类化合物,已将其含量作为衡量甘松品质定性的主要标准. 研究发现,Nar的药理作用主要有镇静、抗癫痫、抗抑郁、促神经生长、改善认知能力、保护心肌细胞、降血压、抑菌与抗疟、抗肿瘤等[7]. Nar可通过激活蛋白激酶A(Protein Kinase A, PKA)促进小鼠胚胎神经干细胞的增殖、迁移和选择性分化;通过细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase, ERK)减少原代培养神经元因缺氧缺葡萄糖诱导的损伤,提高细胞活力;促进神经生长因子诱导的神经生长等[8]. Nar通过抑制核因子-κB(Nuclear Factor-κB, NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)途径治疗相关神经炎症疾病[9]. 另外,Nar可抑制NF-κB配体诱导的破骨细胞生成,减轻脂多糖诱导牙槽骨吸收等. 在心血管研究中发现,Nar可阻断SD大鼠心室肌细胞钠离子通道电流或通过影响cAMP-PKA信号通路,抑制心律失常大鼠心肌细胞钙超载,从而发挥抗心律失常作用,以及通过靶向磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinase, PI3K)/Akt和MEK/ERK信号通路,减轻血管紧张素Ⅱ诱导的H9C2细胞肥大等.
尽管Nar在神经生长、心律失常和心肌肥大中有着重要作用,但Nar在心肌低氧损伤中是否有作用及该过程是否由自噬介导还未见报道. 因此,本研究利用氯化钴(CoCl2)模拟H9C2心肌细胞低氧,探讨Nar干预的作用及机制.
1. 材料与方法
1.1 试剂、药品和仪器
甘松新酮(SN8280,北京索莱宝,纯度≥98%);氯化钴(Sigma);3-MA(Selleckchem);DMEM高糖培养基和胰蛋白酶(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物工程研究所);CCK-8试剂盒(北京同仁);乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究院);Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(上海贝博生物);RIPA裂解液(碧云天生物技术研究所);BCA蛋白浓度测定试剂盒(西安晶彩生物科技有限公司);一抗Caspase-3、β-actin、Bax、Bcl-2、LC3B、Beclin-1、P62和羊抗鼠二抗(ImmunoWay公司);二氧化碳培养箱(美国Thermo公司);分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);低温高速离心机(德国Eppendorf公司);流式细胞仪(美国BD公司);蛋白电泳与转移仪和凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)等.
1.2 细胞培养
H9C2细胞系购自中国科学院上海细胞库. 细胞放置在相对湿度95%、5% CO2、37 ℃培养箱中,以DMEM高糖培养基并补加10%胎牛血清和1%青链霉素培养. 每隔3 d进行一次细胞传代,选用对数生长期细胞进行实验.
1.3 细胞活性检测
细胞以5×103个/孔的密度接种在96孔板中,24 h后,分别以CoCl2(0、50、100、200、500、1 000 μmol/L)孵育24 h. 根据CCK-8试剂盒说明测定细胞活力. 后续实验选用CoCl2半最大效应浓度(EC50)500 μmol/L进行细胞低氧造模. 另外,用Nar(0、10、50、100、200 μmol/L)预处理细胞24 h后,再用CoCl2(EC50)作用24 h,CCK-8检测细胞活力.
1.4 流式细胞仪测细胞凋亡
细胞以5×104个/孔的密度接种在6孔板中,24 h后,分为对照组(0.1% DMSO作用48 h)、CoCl2组(500 μmol/L CoCl2作用24 h)、Nar组(50 μmol/L Nar作用24 h)和Nar+CoCl2组(Nar预作用24 h后,CoCl2再作用24 h). 根据Annexin V-FITC/PI试剂盒说明处理细胞,通过流式细胞仪检测细胞凋亡.
1.5 Western Blot
细胞以5×104个/孔的密度接种在6孔板中,24 h后,分为对照组(0.1% DMSO)、CoCl2组(500 μmol/L)、Nar组(50 μmol/L)、Nar+CoCl2组和3-MA+Nar+CoCl2组(5 mmol/L 3MA预处理3 h,随后同Nar+CoCl2组). 在冰上以RIPA裂解缓冲液裂解细胞,提取总蛋白. 用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度. SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白. 电泳完成后,以湿转的方式将蛋白转移到PVDF膜上. 室温下以5%脱脂奶粉封闭2 h,再一抗4 ℃孵育过夜. 根据抗体说明进行稀释. 用到的一抗有:Caspase-3、β-actin、Bax、Bcl-2、LC3B、Beclin-1和P62. TBST洗3次(室温,摇床上缓慢晃动),每次10 min. 二抗室温孵育2 h, TBST洗3遍(同上). 用Bio-Rad分光成像系统曝光.
1.6 氧化应激相关指标检测
细胞以5×104个/孔的密度接种在6孔板中,24 h后,细胞分组同“1.5”. 利用分光光度计测细胞上清液中MDA浓度及SOD、CK和LDH活性.
1.7 统计学分析
每个实验组至少进行3个独立实验. 数据采用Spss19.0统计软件进行分析,所有数据均以平均值±标准差的形式呈现. 采用t检验对2组间进行比较,多组间的比较采用单因素方差分析.
2. 结果与分析
2.1 Nar对CoCl2诱导的H9C2细胞损伤的影响
不同浓度的CoCl2作用H9C2细胞24 h后(图 1A),细胞活力以剂量依赖方式显著降低,500 μmol/L的CoCl2可抑制约50% H9C2细胞生长,故选此浓度造H9C2低氧模型. 不同浓度的Nar预作用H9C2细胞24 h,再以500 μmol/L CoCl2孵育24 h. 结果显示:与CoCl2组比,50、100、200 μmol/L Nar预作用均可提高细胞活力,而50 μmol/L Nar作用最显著(P < 0.01)(图 1B),因此后续实验以50 μmol/L Nar进行分析. 同时,与对照组(细胞不做任何处理组)相比,CoCl2(500 μmol/L)可显著减少细胞数. 而50 μmol/L Nar预干预24 h,可明显减轻CoCl2造成的细胞生长抑制现象(图 1C).
2.2 Nar对CoCl2诱导H9C2细胞凋亡的影响
流式细胞仪检测细胞凋亡发现:CoCl2可引起H9C2细胞凋亡,而Nar明显减轻CoCl2诱导的细胞凋亡(图 2A、B). 与对照组比较,CoCl2组Caspase-3蛋白表达升高,Bcl-2/Bax相对比率降低. 而Nar预作用后,与CoCl2组相比,Caspase-3蛋白表达降低,Bcl-2/Bax相对比率升高(P < 0.01)(图 2C~E). 表明Nar对CoCl2诱导的细胞凋亡有抑制作用.
2.3 Nar对CoCl2诱导H9C2细胞损伤与自噬的关系
为了确定自噬是否介导了Nar对H9C2细胞低氧损伤的保护过程,Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3II/LC3I和P62的表达. 与对照组相比(图 3A),CoCl2组LC3II/LC3I、P62和Beclin-1蛋白表达均增加,这与先前研究结果一致[10]. 而Nar组LC3II/LC3I和Beclin-1蛋白表达显著升高,P62下降. 与CoCl2组相比,Nar+CoCl2组的LC3II/LC3I、Beclin-1和P62表达均降低. 而3-MA预处理可逆转Nar诱导的LC3II/LC3I和Beclin-1蛋白表达增加及P62蛋白表达降低(图 3B). 这些结果表明:Nar通过激活自噬减轻了CoCl2诱导的细胞损伤. CoCl2也激活了自噬,但其对H9C2细胞的作用与Nar明显不同,具体机制有待进一步研究.
2.4 Nar抑制CoCl2诱导H9C2细胞凋亡与自噬的关系
为进一步探讨Nar激活自噬与CoCl2诱导H9C2细胞凋亡的关系,以3-MA预作用3 h,Western Blot检测凋亡相关蛋白表达. 结果表明:3-MA预作用组与Nar+CoCl2组相比,Caspase-3蛋白表达升高而Bcl-2/Bax降低,表明3-MA逆转了Nar的抗凋亡作用(图 4A~C). 说明Nar以激活自噬方式对抗CoCl2诱导的凋亡.
2.5 Nar减轻CoCl2诱导H9C2细胞凋亡与氧化应激的关系
氧自由基的升高是低氧诱发心肌损伤的重要原因之一. 过量的氧自由基会攻击生物膜诱发脂质过氧化,致使心肌中MDA含量增加,影响脂质的生物学功能. 同时心肌损伤后会引起细胞膜结合酶的泄露,如血清中CK和LDH水平的升高,最终引起细胞凋亡. 与CoCl2组相比(图 5A~D),Nar预处理显著提高H9C2细胞SOD水平,降低CK、MDA和LDH水平. 而3-MA预作用降低SOD水平,提高CK、MDA和LDH水平,从而逆转了Nar对CoCl2诱导细胞损伤的抗氧化作用. 结果表明:Nar激活自噬减轻了CoCl2对H9C2细胞的氧化损伤.
3. 讨论
CoCl2因其二价钴离子可以取代脯氨酰羟化酶辅因子(二价铁离子),已广泛用于包括H9C2细胞在内的各种细胞系模拟低氧条件. 本研究中CoCl2(500 μmol/L)对H9C2细胞生长有明显抑制作用,而Nar(50 μmol/L)预作用可减轻CoCl2(500 μmol/L)引起的细胞生长抑制现象. LI等[8]也报道Nar(50和100 μmol/L)能保护因低氧和缺糖引起的神经元损伤,并提高细胞活力. LI等[11]发现Nar有促神经干细胞增殖、增加细胞迁移和分化的作用. 这些结果提示:Nar可促进H9C2细胞低氧损伤条件下的生长.
Bcl-2家族是凋亡过程的主要调节因子,包括促凋亡蛋白如Bax和抗凋亡蛋白如Bcl-2[12-13]. Bcl-2/Bax决定了细胞是增殖还是凋亡[14]. 此外,Caspase-3是凋亡过程的关键执行者[15]. 本研究发现,Nar可降低CoCl2诱导的H9C2细胞凋亡,并减少Caspase-3蛋白表达,使Bcl/Bax比降升高,表明Nar通过抑制细胞凋亡减轻了CoCl2诱导的H9C2细胞损伤.
心肌细胞在缺血状态下因缺乏足够的葡萄糖、氨基酸和能量等而导致自噬被激活[16]. 正常生理活动中,自噬通过调节细胞代谢以适应营养供应和清除受损细胞器,从而起到维持细胞内稳态的作用[17]. 但在极端条件下,如慢性或极度低氧,激活自噬会引发细胞凋亡[18]. 在各种自噬相关基因中,Beclin-1和LC3B在协调自噬的细胞保护功能中有着重要作用,二者同时可对抗凋亡[19]. LC3B由LC3I和LC3II组成,自噬激活后LC3I转化为LC3II. 因此LC3II/LC3I反应了自噬体的形成程度[20]. Beclin-1表达在自噬体形成的初始阶段[21]. P62有向自噬体传递泛素结合蛋白复合物,并以自噬体溶酶体融合机制促进降解的作用,故自噬激活后,细胞内P62水平降低[17]. 本研究Western Blot结果显示:Nar和CoCl2均可激活自噬,但作用机制不同. CoCl2诱导细胞凋亡可能增加了自噬体形成通量,而不是降低清除率. Nar激活自噬可能增加了损伤细胞器的清除,从而对CoCl2诱导的H9C2细胞低氧损伤起保护作用. 另有研究发现,缺血预处理以激活自噬的形式对心脏起保护作用[22-23],且缺血预处理后,LC3II/LC3I和Beclin-1表达增加[24],与本研究中Nar作用一致. 因此,Nar可能具有保护H9C2细胞免受CoCl2诱导凋亡的低氧预处理作用,具体机制需要进一步验证. 另外,3-MA预作用明显增加了Nar+CoCl2组细胞凋亡的发生,表明Nar诱导的自噬对CoCl2造成的低氧损伤有抗凋亡作用.
SOD是细胞内抗氧化剂,有清除自由基的作用[25]. MDA是脂质过氧化的一个关键指标,可间接反应细胞的损伤程度[26-27]. 另外,CK和LDH是心肌损伤的标志物. 通常细胞上清中LDH活性增加与细胞死亡的程度相关[28],而CK可直接反应心肌受损程度[29-31]. 本研究中,CoCl2作用后引起的SOD下调,MDA、LDH和CK的上调被Nar预作用所逆转,表明Nar能改善CoCl2诱导的H9C2细胞氧化损伤,但当3-MA预作用时,SOD、MDA、LDH和CK水平接近CoCl2组水平,表明Nar以激活自噬起到抗氧化损伤的作用.
综上所述,CoCl2对H9C2细胞可造成凋亡和氧化损伤,Nar通过激活自噬对CoCl2造成的H9C2细胞损伤有促生长、抗凋亡和抗氧化作用.
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图 4 Nar抑制CoCl2诱导H9C2细胞凋亡与自噬的关系
注:与对照组比较,*表示P < 0.05,**表示P < 0.01;与CoCl2组比较,#表示P < 0.05,##表示P < 0.01;与Nar+CoCl2组比较,∧表示P < 0.05,∧∧表示P < 0.01. 图 5同.
Figure 4. The relationship between Nar inhibiting CoCl2-induced H9C2 cell apoptosis and autophagy
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