The Preparation of Novel Bone-repair Materials of Gelatin-amorphous Calcium Phosphate through Three-dimensional Printing
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摘要: 首先采用共沉淀法制备明胶改性的无定形磷酸钙(ACP)粉末材料，再以纯水作为粘接溶液，通过3D打印机制造骨移植修复材料，并应用红外光谱仪、X射线衍射仪以及扫描电子电镜进行表征. 对于明胶稳定无定形磷酸钙化学结构的相关作用机制给出了初步的解释，重点考察了明胶添加量对打印骨成品的微观形貌、抗压强度以及孔隙率的影响规律，确定了明胶最佳用量为0.15%(质量分数)，此时打印骨成品的抗压强度高达31.7 MPa，孔隙率为30.2%，表明打印骨成品在力学性能和骨传导性之间取得了平衡，可被广泛应用于骨修复临床应用.Abstract: The amorphous calcium phosphate (ACP) modified by gelatin was prepared with the coprecipitation method and then used as prototyping powder for three-dimensional printing (3DP). The 3DP products of bone repair materials were fabricated with deionized water serving as adhesive solution and then characterized with Fourier transform infrared spectroscopy(FT-IR), X-ray diffraction (XRD) and scanning electron microscope (SEM) separately. The mechanism of ACP stabilized with gelatin was initially discussed and the effect of gelatin content on the chemical stability of ACP and the compressive strength as well as porosity of 3DP products were investigated respectively. The optimal dosage of gelatin was determined to be 0.15% (mass fraction) and the corresponding compressive strength and bone conductibility of the 3DP products were 31.7 MPa and 30.2% respectively, at which a balance was obtained between them and the 3DP products could be widely used for repairing bone defects.
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磷酸三钙(Tricalcium Phosphate，TCP)的成分与生物体原生骨组织相近，因而具有优良的相容性、降解速率、骨传导性等生物学性能，并已被广泛应用于骨缺损移植修复等领域[1-2]. 通常，骨缺损的形状、结构、程度因人而异，因此骨修复材料的临床需求也千变万化，导致很难通过诸如骨水泥等传统工艺将TCP制成理想的骨修复材料[3~5]. 随着基于液滴/颗粒交互作用的粉末粘接类3D打印技术日趋成熟，骨修复的关键技术瓶颈才被有效突破. 因为3D打印技术理论上能打印制作任意结构和形状的实体成品，所以该技术非常适合用于小批量制造形状不规则且结构复杂的骨修复材料[6~8]. TCP主要存在无定形磷酸钙(Amorphous Calcium Phosphate，ACP)、高温稳定型α相(α-TCP)以及低温稳定型β相(β-TCP)等3种形态. ACP的安全性、生物活性以及骨传导性最为理想，而且研究证实自然界中生物体骨骼组织绝大多数是以ACP为前驱体，通过相变作用逐渐矿化变成晶态羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)，因此采用3D打印技术将ACP制成骨修复材料在骨科领域占有极其重要的地位，是当前国际生物医学研究热点之一[9-10].
目前，国内ACP/3D打印技术面临着不少关键技术难题. 一方面，ACP化学性质活泼，极易发生相变而转化为HA，其储存周期短，严重阻碍了ACP大规模医学临床应用的步伐. 为了延长ACP的储存寿命，通常加入Mg2+、P2O74-、酪蛋白、聚乙二醇等无机离子或有机大分子对其进行稳定改性，然而稳定效果欠佳[11-12]. 另一方面，ACP/3D打印技术陷入了“会用却不会造”的尴尬技术困境，即对3D打印骨修复材料实体成品的医学临床应用达到了国际一流水平，但在3D打印骨成品制备方面的研究甚少. 打印骨成品制备是其医学应用的前提基础，决定着国内ACP/3D打印技术的发展深度，因此亟需深入系统研究. 鉴于此，本研究以明胶为稳定保护剂，采用共沉淀法制备明胶改性的ACP纳米粉末材料(明胶-ACP)，以纯水为粘接剂，通过3D打印机制造骨修复材料实体成品; 研究明胶对ACP化学结构稳定性和打印骨成品性能的影响规律，并对其相关稳定作用机制进行初步分析.
1. 实验部分
1.1 主要试剂与仪器设备
(NH4)2HPO4和Ca(NO3)2·4H2O购于国药集团化学试剂有限公司，无水乙醇购于南京化学试剂有限公司，明胶购于Sigma-Aldrich化学试剂公司，所有试剂均为分析纯.
恒温恒湿试验箱(TH-80L型，东莞科赛德); 3D打印机(Z 310型，美国Z Corporation); 万能材料试验机(3367型，美国Instron); 扫描电子显微镜(SU8000型，日本Hitachi); X射线衍射仪(D/max-IIIA型，日本Rigaku); Fourier红外光谱仪(370型，美国Nicolet).
1.2 明胶-ACP粉体的制备
明胶-ACP粉体的制备步骤：(1)将1 L纯水通过水浴加热至50 ℃，加入0.5 g明胶并搅拌至完全溶解，配置成0.5 g/L的明胶溶液，冷却至室温备用. (2)分别配制0.1 mol/L (NH4)2HPO4溶液与0.1 mol/L Ca(NO3)2溶液. (3)依次向96 mL Ca(NO3)2溶液中加入1、2、3、4、5 mL明胶溶液(最终粉末材料中明胶的质量分数w(明胶)依次为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)，搅拌均匀; 然后一次快速倒入64 mL Na2HPO4溶液中，强烈搅拌30 min. (4)真空抽滤，用100 mL无水乙醇洗涤3次，再将滤饼充分冷冻干燥.
稳定性测试：为了快速衡量明胶-ACP保持无定形状态的能力，将其放入恒温恒湿试验箱中保养，温度和相对湿度分别设为65 ℃、95% RH.
1.3 打印操作与实体成品性能检测
首先将明胶-ACP充分研磨，再筛分收集粒径约74 μm(200目)的粉末材料; 然后将其和纯水分别装入3D打印机的供粉缸和墨盒中; 最后在室温下打印制取尺寸为20 mm×20 mm×20 mm的骨修复材料. 打印参数设置：喷头与粉末层相距2 mm; 铺粉层厚度设为0.1 mm; 铺粉辊转速设为100 r/min; 饱和度设为0.8;喷射扫描模式设为0.4 m/s、0.2 mm. 打印完毕，静置老化12 h后取出打印骨成品，去除未参与成型的多余粉末.
抗压强度测试：采用万能材料试验机按照GB/T 15231.2-94进行测量.
孔隙率测试：参考文献[13].
微观结构特征分析：采用扫描电子显微镜对打印骨成品的纵向截面进行观测.
X射线衍射(XRD)测试：采用X射线衍射仪表征明胶-ACP和打印骨成品的物相.
傅立叶变换红外(FT-IR)光谱测试：采用KBr压片法在红外光谱仪上分析明胶-ACP和打印骨成品表面的官能团.
2. 结果与讨论
2.1 明胶-ACP的稳定性分析
在恒温恒湿(65 ℃、95% RH)条件下，测得明胶-ACP不发生晶化现象的最长时间(图 1). 对明胶-ACP保养10周后进行XRD测试(图 2).
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图 1 恒温恒湿条件下明胶-ACP的储存寿命Figure 1. The storage lifetime of gelatin-ACP under constant temperature and humidity![]()
图 2 恒温恒湿保养10周后明胶-ACP的XRD图谱Figure 2. The XRD patterns of gelatin-ACP stored 10 weeks under constant temperature and humidity未经任何改性的ACP具有无定形化学结构，非常不稳定，室温下即使置于真空环境也仅能稳定储存4周左右[11-12, 14]. 由图 1、图 2可知，少量的明胶即可有效阻止ACP发生水化相变，并且随着w(明胶)的增加，其无定形结构保持稳定的能力越强. 当w(明胶)=0.05%时，在2θ=25.8°处出现HA的(002)晶面特征衍射峰，但(211)以及其他晶面的特征衍射峰并没有出现，表明在明胶的稳定保护作用下，此时仅有一部分ACP通过水化反应变为结晶态HA. 当w(明胶)增至0.10%时，(002)晶面的衍射峰明显减弱，说明随着w(明胶)的增加，ACP的晶化程度显著降低，意味着更少的ACP发生了水化相变. 当w(明胶)继续增加时，(002)晶面衍射峰则完全消失，同时在2θ=30°左右出现馒头峰，这是ACP无定形状态的特征衍射峰，证实ACP无定形结构保持完好，没有明显的晶相物质出现[15].
向ACP中加入少量明胶可有效稳定其无定形结构，这主要是因为明胶大分子中-COOH与ACP中的Ca2+发生反应而吸附于ACP颗粒表面. 一方面，明胶通过大分子链的空间位阻效应，有效延缓了ACP颗粒的团聚和长大; 另一方面，明胶显著隔断了Ca2+、PO43-等离子在溶液与ACP的Posner团簇之间的迁移、扩散以及重排，有效抑制了Posner团簇结构转变成HA晶体，从而使其保持长时间的稳定[14, 16-17].
2.2 明胶质量比对打印骨成品性能的影响
改变w(明胶)，最终打印骨成品的抗压强度和孔隙率的变化趋势如图 3所示. 随着w(明胶)的增加，骨成品的抗压强度先增大后减小，而其孔隙率则持续缓慢降低. 在3D打印成型过程中，ACP颗粒表面被水滴润湿后立即发生水化反应，所生成的HA晶体不断析出并互相重叠搭接成整体. 同时，明胶也吸收水分而溶胀，其大分子链在HA晶体的孔隙结构中伸展并缠绕成膜，给骨成品内部赋予了良好的柔韧性. 此时当骨成品受到外力作用时，明胶大分子链可及时提供足够的缓冲，从而避免因应力集中而产生脆性破坏，因此抗压强度随w(明胶)的增加而增大[13]. 但是，当w(明胶)过大时，一方面，包裹在ACP颗粒表面的明胶高分子形成一层膜，从而阻止水分子与ACP接触，显著阻止ACP发生水化反应; 另一方面，明胶通过空间位阻作用和阻断离子迁移的方式抑制晶相磷酸钙形成与生长效应开始凸显，明显抑制了ACP的水化相变过程. 在这两方面的共同作用下，ACP的水化反应被严重阻滞，超过了明胶高分子膜的增韧作用，造成HA晶体联接的紧密性下降，进而使得骨成品的抗压强度反而减小.
由于打印粉末层部分原有孔隙结构会被明胶水化后舒展的大分子链占据，所以骨成品的孔隙率随w(明胶)的增加而不断减小. 为了提高骨传导性，促进骨细胞的生长、组织液的渗入、营养成分的输送以及血管彼此连通，骨成品的孔隙数量需要尽可能丰富发达. 力学性能和孔隙数量均为骨成品医学临床应用的关键性能，但二者互相矛盾. 虽然孔隙数量越高骨传导性越好，但力学性能越差. 因此，在无定形相保持稳定的基础上，当w(明胶)=0.15%时，二者取得了最佳平衡; 此时明胶-ACP于恒温恒湿环境下的储存寿命为16周，基本满足产品商业化要求，同时骨成品抗压强度和孔隙率分别为31.7 MPa和30.2%，不仅骨传导性良好，而且力学性能接近承重骨的要求，大大拓展了人工骨修复材料的临床应用范围.
2.3 明胶的质量比对打印骨成品形貌的影响
采用不同w(明胶)的明胶-ACP粉体，打印制作骨成品，采用扫描电子显微镜观察纵截面的微观形貌(图 4). 明胶的引入对HA晶体的形貌影响大，尽管都呈现不规则且表面粗糙的块层状，但具有比较明显的差异. 随着w(明胶)的增加，ACP水化反应被抑制的程度逐渐增加，导致HA晶体块层的舒展程度逐步变差，块层的整体面积逐渐减小，同时团聚现象愈加明显. 当w(明胶)≤0.15%时，HA晶体不仅水化反应程度比较充分，而且分布较为均匀，因此其孔隙结构更加丰富(图 3)，既存在较多的微细孔，也含有一些大孔，所以骨成品的骨传导性较好; 此时由于明胶高分子膜的增韧作用占主导，因而力学性能比较优良(图 3). 而当w(明胶)≥0.20%时，不仅HA晶体团聚比较严重，而且孔隙数量明显减少(图 3)，这主要是由于此时w(明胶)过大，显著抑制了ACP水化反应，因而导致力学性能(图 3)和骨传导性的迅速恶化，不满足医学的临床应用需求.
2.4 打印骨成品的结构分析
在最优条件w(明胶)=0.15%)下，打印骨成品的XRD分析如图 5所示. 在2θ=25.8°和31.9°处的峰归属于HA(002)和(211)这2个晶面的特征衍射峰，表明骨成品主要成分是HA，说明经过3D打印过程中的液-固作用后，大部分明胶-ACP已基本转变成HA晶体[11-12, 15, 18]. 但是，HA的其它晶面(如(112)、(300)、(310)等)的特征衍射峰完全消失，表明骨成品中还残留部分尚未水化的明胶-ACP，这主要是由3D打印成型过程特点所决定的. 粉末3D打印技术主要依赖于水滴在明胶-ACP粉末层孔隙结构中的润湿、铺展以及毛细渗透等过程，明胶-ACP发生水化反应生成HA晶体从而逐层成型. 由于粉末层孔隙结构所容纳的水体积远小于ACP完全水化相变所需的水体积，在距离孔隙结构通道较远的区域，部分明胶-ACP粉体无法及时接触水分子而保持无定形状态[19-21]. 此时将骨成品移植进入生物体后，一方面，骨成品不仅在短期内与原生骨紧密黏附，而且HA晶体直接转化成新骨，从而显著增强了移植部位的力学性能，使之具有优良的抗应力性能; 另一方面，骨成品内部尚未水化的明胶-ACP在体液作用下迅速发生水化并转化为微小HA晶种，有效提升了新骨在骨成品孔隙结构中的生长速度以及新骨与骨成品的键合程度(即骨传导性和生物相容性好)，直至骨成品最终被新骨完全替代，显著利于骨成品的医学临床应用[14, 22-23].
在最优条件(w(明胶)=0.15%)下，明胶-ACP粉体与打印骨成品的FT-IR分析如图 6所示. 在波数为1 541 cm-1处的吸收峰对应于酰胺结构中C—N伸缩振动或N—H弯曲振动，在波数为470 cm-1和1 080 cm-1处的吸收峰归属于PO43-非对称伸缩振动，证实明胶-ACP粉体与打印骨成品均为明胶改性的磷酸钙. 在明胶-ACP的红外光谱中，波数为580 cm-1处的吸收峰归属于PO43-的弯曲振动，其尖锐且未分裂，证实粉体为无定形态; 而在骨成品的红外光谱中，该峰被劈裂成波数为560 cm-1和600 cm-1处的2个吸收峰，表明明胶-ACP已通过水化反应变成HA晶体[12, 14-15, 18, 23]. 但该峰未彻底劈裂，这表明骨成品中存在少量未水化完全的明胶-ACP，尚存在少量无定形态，这与XRD的分析结果相一致.
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图 6 明胶-ACP粉体与打印骨成品的红外光谱Figure 6. The infrared spectra of the optimal gelatin-ACP and 3DP product3. 结论
明胶主要通过空间位阻作用和阻断离子迁移的方式有效地稳定ACP的Posner团簇结构，明胶的质量分数w(明胶)对ACP的水化相变反应与骨成品应用性能的影响比较明显. 随着w(明胶)的不断增大，ACP的化学结构趋于稳定，但其水化反应能力受到抑制，孔隙率逐渐降低. 当w(明胶)=0.15%时，ACP无定形结构在高温(65 ℃)高湿(95% RH)环境下可稳定保持16周，骨成品的抗压强度为31.7 MPa，孔隙率为30.2%，兼顾了无定形相的稳定性以及骨成品的力学性能和骨传导性，满足某些缺损承重骨的修复治疗应用.
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图 1 恒温恒湿条件下明胶-ACP的储存寿命
Figure 1. The storage lifetime of gelatin-ACP under constant temperature and humidity
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图 2 恒温恒湿保养10周后明胶-ACP的XRD图谱
Figure 2. The XRD patterns of gelatin-ACP stored 10 weeks under constant temperature and humidity
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