The Cloning and Functional Analysis of the Transcription Factor bHLH in Purple-Fleshed Sweet Potato
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摘要: 通过对紫心甘薯中bHLH类转录因子的基因进行分子克隆,对其结构、表达模式及功能进行研究,明确了其结构特征和生物学功能.通过采用RACE克隆方法,获得了编码bHLH基因且长度分别为2 516 bp和2 304 bp的cDNA全序列.基于DNA序列的分子进化树分析结果表明:两者分别属于植物bHLH1和bHLH2基因家族的成员,分别将其命名为IbbHLH1(GenBank登录号:KC708871)和IbbHLH2 (GenBank登录号:JF508437);IbbHLH1和IbbHLH2蛋白均定位于细胞核; 在3个甘薯品种(系)的块根中,IbbHLH2基因与花色素苷合成途径中的酶基因(CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和3GT)的表达量变化趋势相一致,初步推测转录因子IbbHLH2可能参与了紫心甘薯花色素苷合成途径一系列酶基因的表达与调控.Abstract: The gene of the bHLH transcription factor in purple-fleshed sweet potato was cloned, and its structure, expression pattern and function were studied to reveal its structural characteristics and biological functions. The full cDNA sequences encoding the bHLH gene and having a length of 2 516 bp and 2 304 bp respectively were obtained with the RACE cloning method. The molecular phylogenetic tree analysis based on the DNA sequence showed that the two sequences belonged to the bHLH1 and bHLH2 plant gene families respectively. They were named IbbHLH1 (GenBank accession number: KC708871) and IbbHLH2 (GenBank accession number: JF508437). The IbbHLH1 and IbbHLH2 proteins were localized in the nucleus. The results of semi-quantitative RT-PCR showed that the expression level of IbbHLH2 and that of anthocyanin synthase genes (CHS, CHI, F3H, DFR, ANS and 3GT) were consistent in the roots of three sweet potato cultivars (strains). It is preliminarily speculated that the transcription factor IbbHLH2 is involved in the expression and regulation of a series of enzyme genes in the anthocyanin synthesis pathway of purple-fleshed sweet potato.
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Keywords:
- purple-fleshed sweet potato /
- anthocyanin /
- bHLH1 /
- bHLH2 /
- transcription factor /
- expression regulation
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在拓扑动力系统中,拓扑熵[1]是一个拓扑共轭不变量,可用来刻画系统的复杂程度。非紧集的拓扑熵[2-3]与测度熵、Lyapunov指数等密切相关[4-11],可用来研究系统中的重分形谱[12]、饱和集[6]和非正则集等[5, 7]。
学者们从多个角度对拓扑熵进行了深入研究,发现系统中满足一定条件的零测集具有与整个系统相同的拓扑熵或Hausdorff维数。如:BARREIRA和SCHMELING[4]证明了针对拓扑混合的有限型子转移,如果Hölder连续函数g对0是非上同调的,那么g的Birkhoff平均不规则集上的拓扑熵等于这个有限型子转移的拓扑熵; PESIN[5]证明了针对符号系统,非generic点集上的拓扑熵等于整个系统的拓扑熵; CHEN等[6]证明了满足specification性质的非正则集上的拓扑熵等于整个系统的拓扑熵; TIAN[7]证明了系统中若干周期类点集的差集上的拓扑熵等于整个系统的拓扑熵; ZHU和MA[8]将文献[6-7]的结论推广到了自由半群作用的系统中。
在迭代函数系统(IFS)中,ELTON[13]得到了一个遍历定理(Elton定理):对任意连续函数,符号空间中几乎所有的点,IFS的时间平均等于空间平均。受文献[4-8]的启发,本文探讨符号空间中Elton定理不成立的点构成的集合的性质及其拓扑熵、Hausdorff维数与整个系统的拓扑熵、Hausdorff维数的关系。
1. 主要结果
设(X, d)是紧致度量空间。映射T: X→X称为一个压缩映射,如果d(T(x),T(y))⩽θd(x,y), ∀x,y∈X,其中θ(0 < θ < 1)是一个常数。如果{T0, T1, …, Tm-1}是X上的压缩映射族,那么称(X, T0, T1, …, Tm-1)为迭代函数系统(IFS)。由文献[14]可知,对于迭代函数系统(X, T0, T1, …, Tm-1),如果存在唯一的非空子集E⊂X,使得E=m−1⋃j=0Tj(E),则E被称为(X,T0,T1,⋯,Tm−1)的吸引子。
设(X, T0, T1, …, Tm-1)是一个迭代函数系统,(p0, p1, …, pm-1)是一个概率向量,即pi>0(0⩽i⩽m−1),∑m−1i=0pi=1。HUTCHINSON[14]证明了存在唯一的Borel概率测度ν,使得对所有的Borel集Z⊂X,有
ν(Z)=m−1∑j=0pjν(T−1jZ) 且supp ν是(X, T0, T1, …, Tm-1)的吸引子E, 这个概率测度ν称为是(X, T0, T1, …, Tm-1)的关于概率向量(p0, p1, …, pm-1)的不变测度。
设Σ=∞∏n=1{0,1,⋯,m−1}为符号空间,(p0, p1, …, pm-1)是一个概率向量,P为由每一个因子的测度p({i})=pi诱导的乘积测度。
1987年,ELTON[13]得到了迭代函数系统(X, T0, T1, …, Tm-1)中的一个遍历定理:
定理A[13] (Elton定理)对于X上的任意连续函数f和任意x∈X, 有
lim 相对于乘积测度P而言,对几乎所有的(j0, j1, …)\in Σ成立。
对任意f\in C(X)和任意x \in X,记f的Elton定理不成立的点构成的集合为
\begin{aligned} &B_1(f, x)=\left\{\left(j_0, j_1, \cdots\right) \in \varSigma \mid \lim _{n \rightarrow \infty} \frac{1}{n} \sum\limits_{i=0}^{n-1} f\left(T_{j_i} \circ T_{j_{i-1}} \circ \cdots \circ\right.\right. \\ &\left.T_{j_0}(x)\right) \text { 不存在\}。 } \end{aligned} 根据定理A,对Σ上的每一个乘积测度P,均有P(B1(f, x))=0,B1(f, x)是σ-不变的,其中σ是Σ上的推移映射。
本文研究集合B1(f, x)的拓扑熵、Hausdorff维数与整个系统的拓扑熵、Hausdorff维数的关系。
设A为m×m阶矩阵,A的每个元素aij取值为0或1。设\varSigma_A \subset \varSigma是紧致的σ-不变子集,使得任意(i0, i1, …)\in ΣA,满足ain in+1 =1,n≥0,映射σ|ΣA称为由矩阵A决定的有限型子转移。称σ|ΣA拓扑混合当且仅当存在一个正整数k,使得Ak的所有元素的值都是正的。σ|ΣA的拓扑熵为h(σ|ΣA)=log ρ(A)[15],其中ρ(A)表示A的谱半径。
如果存在连续函数\psi: \varSigma_A \rightarrow \mathbb{R},存在c \in \mathbb{R},使得g_1-g_2=\psi-\psi \circ \sigma+c,则称2个函数g_1, g_2: \varSigma_A \rightarrow \mathbb{R} 是上同调的。对于每一个连续函数g: \varSigma_A \rightarrow \mathbb{R},定义g的Birkhoff平均的不规则集为
B(g)=\left\{\left(j_0, j_1, \cdots\right) \in \varSigma_A \mid \lim _{n \rightarrow \infty} \frac{1}{n} \sum\limits_{i=1}^n g\left(\sigma^k\left(j_0, j_1, \cdots\right)\right)\right. \text { 不 } \\ 存在\}。 注意,集合B(g)是σ-不变的。根据Birkhoff遍历定理[15],对于ΣA上每一个σ-不变测度μ,有μ(B(g))=0。1997年,BARREIRA和SCHMELING[4]证明了满足一定条件的Birkhoff平均不规则集上的拓扑熵等于这个有限型子转移的拓扑熵。
定理B[4] 对于拓扑混合的有限型子转移,如果Hölder连续函数g对0是非上同调的,那么
h(\sigma \mid B(g))=h\left(\sigma \mid \varSigma_A\right), 其中,h(σ|B(g))、h(σ|ΣA)分别表示B(g)、ΣA上的σ拓扑熵,B(g)表示g的Birkhoff平均不规则集,ΣA表示由矩阵A确定的符号空间Σ的σ-不变子集。
下面给出本文定理证明需要用到的一个结论:
定理C[12] 对符号系统(Σ, σ),对任意Z \subset \Sigma,有
h(\sigma \mid Z)=\mathrm{HD}(Z) \cdot \log m, 其中,Σ由m个符号生成,h(σ|Z)表示Z上的拓扑熵,HD(Z)表示Z上的Hausdorff维数。
本文主要结论如下:
定理1 设(X, T0, T1, …, Tm-1)是一个迭代函数系统,对任意g\in C1(X)和任意x \in X,这里C_1(X)=\{g \in \left.C(X) \mid \int_X g \mathrm{~d} \nu_1 \neq \int_X g \mathrm{~d} \nu_2, \forall \nu_1, \nu_2 \in M(X), \nu_1 \neq \nu_2\right\}, M(X)表示(X, T0, T1, …, Tm-1)中关于所有概率向量的不变测度的集合,有
h\left(\sigma \mid B_1(g, x)\right)=h(\sigma)=\log m, 即B1(g, x)是满熵的,且具有满Hausdorff维数。
证明 仿照定理B的证明方法,设(p0, p1, …, pm-1)和(q0, q1, …, qm-1)是任何概率向量,且
\left(p_0, p_1, \cdots, p_{m-1}\right) \neq\left(q_0, q_1, \cdots, q_{m-1}\right)。 设P1、P2分别表示由(p0, p1, …, pm-1)、(q0, q1, …, qm-1)诱导的乘积测度,ν1、ν2分别表示(X, T0, T1, …, Tm-1)关于(p0, p1, …, pm-1)、(q0, q1, …, qm-1)的不变测度,则有P1≠P2, ν1≠ν2。给定ε>0,存在概率向量(p0, p1, …, pm-1)和(q0, q1, …, qm-1),使得(p0, p1, …, pm-1)≠(q0, q1, …, qm-1),hPi(σ)>h(σ)-ε(i=1, 2)。其中hPi(σ)表示关于Pi的σ测度论熵。因为ν1≠ν2,所以\int_X g \mathrm{~d} \nu_1 \neq \int_X g \mathrm{~d} \nu_2, g \in C_1(X)。选择δ\in (0, ε), 使得\left|\int_X g \mathrm{~d} \nu_1-\int_X g \mathrm{~d} \nu_2\right|>4 \delta。固定x \in X, 设Γil(i=1, 2;l≥1)表示Σ中满足下面不等式的点(j0, j1, …)构成的集合:对任意n≥l,满足
\left|\frac{1}{n} \sum\limits_{i=0}^{n-1} g\left(T_{j_i} \circ T_{j_{i-1}} \circ \cdots \circ T_{j_0}(x)\right)-\int_X g \mathrm{~d} \nu_i\right| <\delta。 令p_s=s(\bmod 2), l_s是正整数的递增序列,使得对每一个整数s \geqslant 1, 有P_{p_s}\left(\Gamma_{P_s}^{l_s}\right)>1-\varepsilon / 2^s。令m_1= n_1=l_1, m_s=\left(n_{s-1}+1+l_{s+1}\right)!, n_s=n_{s-1}+1+m_s。构造如下柱集族:\mathscr{C}_s=\left\{C_{m_s}\left(j_0, j_1, \cdots\right) \mid\left(j_0, j_1, \cdots\right) \in \Gamma_{p_s}^{l_s}\right\}, \mathscr{D}_1= \mathscr{C}_1和\mathscr{D}_s=\left\{\underline{C} C \bar{C} \mid \underline{C} \in \mathscr{D}_{s-1}, \bar{C} \in \mathscr{C}_s\right., 柱集的长度|C|=1}。
令\varLambda=\bigcap\limits_{s \geqslant 1} \cup C ,定义Λ上的测度μ如下:
\begin{gathered} \mu(C)=P_1(C), C \in \mathscr{D}_1=\mathscr{C}_1, \\ \mu(\underline{C} C \bar{C})=\mu(\underline{C}) P_{p_s}(\bar{C}), \underline{C} C \bar{C} \in \mathscr{D}_s, s>1 。 \end{gathered} 对于每个可测集A \subset \varSigma,令\mu(A)=\mu(A \cap \varLambda),则μ扩展到了Σ上。
如果s>1, \underline{C} \in \mathscr{D}_{s-1},那么
\mu\left(\bigcup\limits_{\bar{C} \in \mathscr{D}_s} \underline{C} \cap \bar{C}\right) \geqslant \mu(\underline{C})\left(1-\frac{\varepsilon}{2^s}\right)。 如果ε < 2,那么
\mu(\varLambda) \geqslant \prod\limits_{s=1}^{\infty}\left(1-\frac{\varepsilon}{2^s}\right)>0。 设\left(j_0, j_1, \cdots\right) \in C \in \mathscr{D}_s ,由于\left(j_{|C|-m_s}, j_{|C|-m_s+1}, \cdots\right) \in \Gamma_{p_s}^{l_s},当s \rightarrow \infty 时,有\frac{|C|}{m_s} \rightarrow 1足够大,那么
\begin{aligned} &\left|\frac{1}{|C|} \sum\limits_{i=0}^{|C|} g\left(T_{j_i} \circ \cdots \circ T_{j_0}(x)\right)-\int_X g \mathrm{~d} \nu_{p_s}\right| \leqslant\\ &\left|\frac{1}{m_s} \sum\limits_{i=0}^{m_s} g\left(T_{j_{\mid C 1-m_s+i}} \circ \cdots \circ T_{j_1 \mid 1-m_s}(x)\right)-\int_X g \mathrm{~d} \nu_{p_s}\right| \times\\ &m_s \sum\limits_{i=0}^{|C|} g\left(T_{j_i} \circ \cdots \circ T_{j_0}(x)\right)\\ &|C| \sum\limits_{i=0}^{m_s} g\left(T_{j_{\mid C l}-m_s+i} \circ \cdots \circ T_{j_{|C|-m_s}}(x)\right) \end{aligned} \begin{aligned} &\left|1-\frac{m_s \sum\limits_{i=0}^{m_s} g\left(T_{j_i} \circ \cdots \circ T_{j_0}(x)\right)}{|C| \sum\limits_{i=0}^{m_s} g\left(T_{j_{|C|}-m_s+i} \circ \cdots \circ T_{\mathrm{j}_{|C|-m_s}}(x)\right)}\right| \times\\ &\left|\int_X g \mathrm{~d} \mu_{v_{p_s}}\right| <2 \delta。 \end{aligned} 由于\delta \in(0, \varepsilon),可知\varLambda \subset B_1(g, x)。现在设\left(j_0\right., \left.j_1, \cdots\right) \in \varLambda,如果q足够大,那么
-\frac{\log \left(\mu\left(C_q\left(j_0, j_1, \cdots\right)\right)\right)}{q} \geqslant h(\sigma)-\eta 对某\eta \in(0, 2 \varepsilon)成立。这意味着
h\left(\sigma \mid B_1(g, x)\right) \geqslant h(\sigma \mid \varLambda) \geqslant h_{\mu \mid \varLambda}(\sigma) \geqslant h(\sigma)-2 \varepsilon 由于ε是任意的,则h\left(\sigma \mid B_1(g, x)\right)=h(\sigma)。
此外,由定理C可得
\mathrm{HD}\left(B_1(g, x)\right)=\frac{h\left(\sigma \mid B_1(g, x)\right)}{\log m}=\frac{h(\sigma)}{\log m}=\mathrm{HD}(\varSigma)。 证毕。
2. 例子
例1 设X=[0, 1], T_0: x \mapsto \frac{1}{3} x, T_1: x \mapsto \frac{1}{3} x+ \frac{2}{3} \circ\left(X, T_0, T_1\right)的吸引子是Cantor集E:
\begin{aligned} E=& T_0(E) \cup T_1(E)=\left\{x_{i_0 i_1 \cdots}:=\bigcap\limits_{n=0}^{\infty} T_{i_0} \circ T_{i_1} \circ \cdots \circ T_{i_n}(E) \mid\right.\\ &\left.\left(i_0, i_1, \cdots\right) \in \prod\limits_{n=1}^{\infty}\{0, 1\}\right\}。 \end{aligned} 取g\in C(X), 使得g(x)=a, x\in [0, 1/3], g(x)=b, x\in [2/3, 1], 这里a≠b。对于任意x \in X,令E(g, x)={xi0 i1… |(i0, i1, …)\in B1(g, x)} E。那么以下结论成立:
(1) 对于任意的x \in X,有
h\left(\sigma \mid B_1(g, x)\right)=h(\sigma)=\log 2, \mathrm{HD}\left(B_1(g, x)\right)=\mathrm{HD}(\varSigma), 这里\varSigma=\prod\limits_{n=1}^{\infty}\{0, 1\}。
(2) 对于任意x \in X,有
\mathrm{HD}(E(g, x))=\mathrm{HD}(E)=\log 2 / \log 3。 例1中的结论(1)可由定理1直接得出。结论(2)中集合E(g, x)是Cantor集E的一个子集,由于系统\left(\prod\limits_{n=1}^{\infty}\{0, 1\}, \sigma\right)与(E, ψ)是拓扑共轭的,E中任一集合与其在\prod\limits_{n=1}^{\infty}\{0, 1\}中的象集有相同的拓扑熵。针对系统(E, ψ),集合E(g, x)上的Hausdorff维数与其拓扑熵有关系,因此,下面给出结论(2)证明中需用到的一个定理:
定理D[11] 对紧致系统(X, f),若存在α>1,对任意充分小的正数ε,当d(x, y) < \varepsilon时,有d(f(x), f(y))=\alpha d(x, y),则对任意Z \subset X,有
h(f \mid Z)=\mathrm{HD}(Z) \cdot \log \alpha。 例1的证明 (1)设(p0, p1)和(q0, q1)为任意概率向量,且(p0, p1)≠(q0, q1)。那么p0≠q0, p1≠q1。设ν1、ν2分别表示(X, T0, T1)关于(p0, p1)、(q0, q1)的不变测度, 则ν1≠ν2,且
\int_X g \mathrm{~d} \nu_1=p_0 a+p_1 b, \int_X g \mathrm{~d} \nu_2=q_0 a+q_1 b。 因此
\begin{aligned} &\left(p_0 a+p_1 b\right)-\left(q_0 a+q_1 b\right)=a\left(p_0-q_0\right)+b\left(p_1-q_1\right)= \\ &\quad\left(p_0-q_0\right)(a-b) \neq 0 \end{aligned} 从而有\int_X g \mathrm{~d} \nu_1 \neq \int_X g \mathrm{~d} \nu_2。根据定理1,对任意x \in X,有
h\left(\sigma \mid B_1(g, x)\right)=h(\sigma)=\log 2, \operatorname{HD}\left(B_1(g, x)\right)=\mathrm{HD}(\varSigma) 。 (2) 对于迭代函数系统(X, T0, T1),可以定义一个连续的自映射
\psi: E \rightarrow E, \\ \psi(x)=T_j^{-1}(x), x \in T_j(E)(j=0, 1), 那么(E, ψ)是一个离散动力系统。定义 \varphi: \prod\limits_{n=0}^{\infty}\{0, 1\} \rightarrow E, \varphi\left(i_0, i_1, \cdots\right)=\bigcap\limits_{n=0}^{\infty} T_{i_0} \circ T_{i_1} \circ \cdots \circ T_{i_n}(E): =x_{i_0 i_1 \cdots}, \forall\left(i_0, \right. \left.i_1, \cdots\right) \in \prod\limits_{n=0}^{\infty}\{0, 1\},则φ是E到 \prod\limits_{n=0}^{\infty}\{0, 1\}的同胚,有\varphi \circ \sigma=\psi \circ \varphi, 也就是说,φ是拓扑共轭,σ是 \prod\limits_{n=0}^{\infty}\{0, 1\}上的推移映射。易见E(g, x)=φ(B1(g, x))。由定理C、定理D和(1),可得
\mathrm{HD}(E(g, x))=\frac{h(\psi \mid E(g, x))}{\log 3}=\frac{h\left(\sigma \mid B_1(g, x)\right)}{\log 3}=\frac{\log 2}{\log 3}。 -
表 1 RACE引物使用表
Table 1 The RACE primer use table
引物名称 引物序列 IbbHLH1F-core 5’- CGTTCAACACCTAAAAACCTCGTATC -3’ IbbHLH1R-core 5’- GAGGACATCAGATAACTGTGGCACTAAC -3’ IbbHLH2F-core 5’-GTGGTTCTACCTCATGTGCATCTCC-3’ IbbHLH2R-core 5’-CGTACTCAATGGTGTCGCCGA-3’ UPM long:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGG TATCAACGCAGAGT-3’short: 5’- CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ NUPM 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ IbbHLH1F-1 5’- CGTTCAACACCTAAAAACCTCGTATC -3’ IbbHLH1F-2 5’- GAGATGGTTGAGCATTCCCCGC -3’ IbbHLH2F-1 5’-TAGAGCAATTCTCGCCAAGTGTG -3’ IbbHLH2F-2 5’-CCGAAACAATATCGAGCATCC-3’ IbbHLH1R-1 5’- CAGTGACTCCAAGCTCGATAACGCCTCCCAAA -3’ IbbHLH1R-2 5’- TCCATCTGCCTGGGGAGCATTGCATAGCC -3’ IbbHLH2R-1 5’-CGTACTCAATGGTGTCGCCGA-3’ IbbHLH2R-2 5’-GTTCCCAGTTCAACCACGCC-3’ 表 2 甘薯半定量RT- PCR引物使用表
Table 2 The semi-quantitative RT-PCR primers for sweet potato
引物名称 引物序列 IbbHLH1RTF 5'-GAAAGGCATCAAAATTAACGTCACC-3 IbbHLH1RTR 5'-CTGTAAACAATTCCCTCAACTGGTA-3 IbbHLH2RTF 5'-TAGGGAGCTTGGACTAGAAATCACG-3 IbbHLH2RTR 5'-TGGCTACCTTGATGTTGTCTCTTGG-3 CHSRTF 5'-GCAGACCTTGGCTCCCGATAG-3' CHSRTR 5'-TTAAGTTGGGACGCTATGGAGG-3' CHIRTF 5'-GTTAAGTGGAACGGGAAAAG -3' CHIRTR 5'- GAGACGACCGTTTGTGGAAT -3' F3HRTF 5'-GGTGGAGGGCAGTAACGGAAAAGTA-3' F3HRTR 5'-CGCCGGATTCTGAAACGTCGCTATA-3' DFRRTF 5'-TGAACTACCGAAAGCGGACAC-3' DFRRTR 5'-GGTGGGAATGTTGGGGTGAT-3' ANSRTF 5'-CCTCACCTTCATCCTCCACAACA-3' ANSRTR 5'-AACCCATAATAATACCAAACGGACT-3' UF3GTRTF 5'-TTCGGGAAGATCGTGCCGTGGG-3' UF3GTRTR 5'-CCAATTTCCCATACACTCTCCACA-3' G14RTF 5'-ATGTCGGACAAGTGCGGAAACTGCG-3' G14RTF 5'-TTAGTGGCCACAGGTGCGGTCGGTA-3' 表 3 IbbHLH1进化保守的氨基酸序列
Table 3 The evolutionarily conserved amino acid sequence of IbbHLH1
位点 名称 433 谷氨酸 434 精氨酸 436 精氨酸 441 天冬酰胺 444 苯丙氨酸 447 亮氨酸 456 赖氨酸 459 赖氨酸 462 异亮氨酸 463 亮氨酸 466 苏氨酸 467 异亮氨酸 469 酪氨酸 473 亮氨酸 表 4 IbbHLH2进化保守的氨基酸序列
Table 4 The evolutionarily conserved amino acid sequence IbbHLH2
位点 名称 477 谷氨酸 478 精氨酸 480 精氨酸 484 亮氨酸 485 天冬酰胺 488 苯丙氨酸 491 亮氨酸 492 赖氨酸 500 赖氨酸 503 赖氨酸 506 异亮氨酸 507 亮氨酸 510 苏氨酸 511 异亮氨酸 513 酪氨酸 514 缬氨酸 517 亮氨酸 -
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