亚硫酸氢根离子(HSO₃^-)被广泛存在于人类的生活环境中.近几十年，随着中国的工业快速发展，SO₂ 逐渐成为了大气中常见的气体污染物. SO₂不仅容易造成酸雨酸雾等危害，而且还能够通过呼吸作用进入人体，并在呼吸系统内与水结合生成H₂SO₃，再通过水解作用形成SO₃^2-和HSO₃^-.研究表明：吸入大量SO₂容易引起急性中毒，人们长期生活在SO₂含量超标的环境中，会严重影响人体呼吸系统和身体健康^[1].同时亚硫酸氢盐在人们的生活和生产中也十分常见，例如：在日常生活中，亚硫酸氢盐常被作为防腐剂和抗氧化剂; 在工业生产中，亚硫酸氢盐常被作为还原剂或防腐剂^[2-3].食品、药品中亚硫酸氢盐和SO₂的含量需要严格控制在安全范围内^[4].因此，发展针对亚硫酸氢根的高灵敏、高特异性且成本低廉的检测方法对于环境监测、食品安全和相关疾病研究均有重要意义^[5].

酶法^[6]、色谱法^[7]、电化学法^[8]、毛细管电泳法、分光光度法^[9-10]、荧光分光光度法^[11]、化学发光法^[12]、磷光光度法^[13]等是HSO₃^-的传统检测方法.但是上述方法存在检出限不够高、抗干扰能力不足、操作繁杂、耗时、昂贵等缺点.然而，与传统方法相比，荧光探针法具有操作简便、更高灵敏度和更高选择性、实时原位、响应速度快、对被测样品无毒或无破坏等优点，因此，荧光探针法被认为是识别活体细胞和组织中微量物质的有效手段^[14].

本文以4-氯-7-硝基苯并呋咱(NBD)为荧光基团，咪唑-4-甲醛为识别基团合成了一种具有低检出限的新型HSO₃^-荧光探针(NBQ)：4-硝基-7-(2-(1-亚甲基咪唑)肼基)苯并呋咱. NBQ可以在二甲基亚砜(DMSO)-水溶液体系中对HSO₃^-表现出高选择性的荧光识别.该研究的成果为检测HSO₃^-提供了一种有效的手段，为NBD类衍生物的阴离子荧光探针应用于生物体和组织中的深入探究提供参考^[15-17].

1.   实验部分

1.1   仪器和试剂

仪器：荧光光谱仪(FL-4600，日本日立，采用的激发波长均为360 nm)、紫外-可见分光光谱仪(UV-2700，日本岛津，光路狭缝为2 nm、扫描范围为250~700 nm)、液相色谱-质谱联用仪(LCQ Deca XP MAX，美国赛默飞)、核磁共振波谱仪(Varian 400 MHz，美国瓦里安)、酸度计(雷磁PHS-3B, 上海精密).

试剂：4-氯-7-硝基苯并呋咱、咪唑-4-甲醛、水合肼(体积分数为80%，全文同)、无水甲醇、氯仿、冰醋酸、二甲基亚砜等试剂均为分析纯，配制溶液用水均为去离子水.

1.2   探针的合成与表征

1.2.1   NBD-NH-NH₂的合成

将NBD-Cl(0.439 2 g，2.20 mmol)溶解于10 mL氯仿中，加入80%(体积分数，全文同)水合肼，混合均匀，室温下搅拌4 h得到棕色沉淀，采用真空泵抽滤，滤饼经过乙酸乙酯洗涤3次，采用真空干燥箱烘干，得到棕色产物NBD-NH-NH₂(0.325 7 g，1.67 mmol)，产率75.9%.反应式如图 1A所示.

图  1  NBD-NH-NH₂与NBQ的合成路线

Figure  1.  The route of NBD-NH-NH₂ and NBQ synthesis

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1.2.2   NBQ的合成

首先将NBD-NH-NH₂(0.203 1 g，1.03 mmol)溶解在5 mL的无水甲醇中，再将咪唑-4-甲醛(0.111 3 g，1.16 mmol)的甲醇溶液缓慢滴加到装有NBD-NH-NH₂的圆底烧瓶中，然后加入冰醋酸作催化剂，将反应混合物置于油浴锅中加热至65 ℃，搅拌回流4 h.待反应结束后将反应混合物静置一夜直至有大量黑色沉淀析出，再将所得粗产物用布氏漏斗抽滤.滤饼用冰甲醇洗涤3次，最后放入真空干燥箱烘干，得到紫红色产物NBQ(0.237 5 g，0.87 mmol)，产率84.5%.反应式如图 1B所示.

1.2.3   NBQ的表征

NBQ的ESI-MS质谱(甲醇为溶剂)数据：分子式C₁₀H₇N₇O₃，相对分子质量的计算值为271.21，实验值为271.83. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)的特征峰归属：δ9.73 (s, 1H), 8.48 (d, J=7.7 Hz, 1H), 8.24 (d, J=48.7 Hz, 1H), 7.97~7.62 (m, 3H), 7.60 (s, 1H).

1.3   溶液的配制

称取一定质量的NBQ，溶于DMSO中配制成浓度为5.0 mmol/L的母液.取12.0 μL的母液加入到4 mL离心管中配制成浓度为20.0 μmol/L含20%(体积分数，全文同)DMSO的水溶液.另外配制浓度为5.0 mmol/L的NaCl、NaHSO₃、NaNO₃、CH₃COONa等水溶液.

2.   结果与讨论

2.1   探针NBQ对HSO₃^-的荧光识别

在含DMSO(20%)的20.0 μmol/L NBQ水溶液中，当激发波长为360 nm时，在574 nm处出现一个很弱的荧光发射峰(图 2).向NBQ水溶液中逐渐滴加NaHSO₃，使HSO₃^-的浓度逐渐增加.可以观察到，在波长为574 nm处很弱的荧光发射峰，其荧光强度随着HSO₃^-浓度的增大而不断增强，同时该发射峰随着HSO₃^-浓度的增大发生了一定程度的红移，荧光颜色由淡蓝色向红色转变.这表明NBQ与HSO₃^-发生了结合反应，同时也表明探针NBQ在该溶液体系中对HSO₃^-具有很高的荧光选择性和灵敏度^[18].

图  2  向探针NBQ的溶液中加入不同浓度HSO₃^-溶液后的荧光发射光谱

注：NBQ溶液的浓度为20.0 μmol/L，溶剂V(DMSO)/V(H₂O)=1/4.滴定后溶液中HSO₃^-的浓度为0.0~100.0 μmol/L.测试的激发波长为370 nm.插图为未加入(左)和加入100.0 μmol/L HSO₃^-后(右)探针NBQ在波长为365 nm的紫外光照射下荧光的变化.

Figure  2.  The fluorescent spectra of NBQ upon addition of HSO₃^- solution

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在相同条件下测试探针NBQ的离子选择性，向20.0 μmol/L的NBQ (V(DMSO)/V(H₂O)=1/4)溶液中分别滴加浓度为100.0 μmol/L的HSO₄^-、NO₃^-、S^2-、Br^-、Cl^-、I^-、S₂O₂^2-、BF₄^-和CH₃COO^-等常见阴离子，并测试其荧光发射光谱(图 3).

图  3  向NBQ中分别加入HSO₃^-和其他阴离子后溶液的荧光光谱

注：NBQ溶液的浓度为20.0 μmol/L，溶剂V(DMSO)/V(H₂O)=1/4. HSO₃^-和其他阴离子溶液的浓度均为100.0 μmol/L.测试的激发波长为370 nm.

Figure  3.  The fluorescent spectra of NBQ solution upon addition of HSO₃^- and other anions

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随着其他阴离子的加入，荧光发射光谱并没有发生明显的变化，只有当加入HSO₃^-时，在波长574 nm处才会出现一个较强的发射峰，说明探针NBQ对HSO₃^-具有较高的选择性.在此基础上进行离子干扰性实验.在添加HSO₃^-(20.0 μmol/L)的同时分别加入其他不同阴离子(100.0 μmol/L)的干扰下测试其荧光发射光谱，观察在波长574 nm处荧光强度的变化情况(图 4)，HSO₃^-混合液与单独加HSO₃^-的情况相比，其荧光增强幅度未出现较大的变化，说明在其他阴离子存在的情况下，NBQ依然能有效地检测HSO₃^-.因此说明NBQ具有较强的抗干扰能力.

图  4  向NBQ溶液中同时加入HSO₃^-和其他干扰阴离子后荧光峰强度的变化

注：NBQ溶液的浓度为20.0 μmol/L，溶剂V(DMSO)/V(H₂O)=1/4. HSO₃^-和其他阴离子溶液的浓度分别为20.0、100.0 μmol/L.发射峰的中心波长为574 nm.

Figure  4.  The emission intensities of NBQ solution upon addition of HSO₃^- mixed with other interring anions

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2.2   NBQ的工作曲线及其与HSO₃^-结合常数

通过对探针进行工作曲线滴定来探究NBQ与HSO₃^-的结合比(物质的量之比)：固定探针NBQ与HSO₃^-的总浓度为20.0 μmol/L，通过加入不同体积的NBQ与HSO₃^-来改变两者的浓度比，检测并计算出加入HSO₃^-前后溶液在波长574 nm处的荧光强度差，然后对HSO₃^-的浓度比c(HSO₃^-/[c(HSO₃^-)+c(NBQ)]作图，即得Job's曲线.当探针NBQ与HSO₃^-形成稳定螯合物时，NBQ的荧光发射强度达到最大值.观察并分析图 5可知，当HSO₃^-的浓度比为50%时，荧光强度差达到最大.因此NBQ与HSO₃^-的最佳结合比为1:1.

图  5  NBQ与HSO₃^-的Job's曲线

Figure  5.  The Job's plot of binding constant for NBQ and HSO₃^-

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利用Hildebrand-Benesi方程^[19-20]拟合并绘制I₀/(I-I₀)对c(HSO₃^-)^-1的线性曲线(图 6A)，得到探针NBQ与HSO₃^-的结合常数K_obs为1.51×10⁴ L/mol，拟合相关系数R²=0.994 2，因此进一步证实了探针NBQ与HSO₃^-以物质的量1:1结合模式的结论.此外，计算得到探针NBQ对HSO₃^-的检出限为14.17 nmol/L(图 6B).

图  6  NBQ与HSO₃^-的结合常数拟合以及检测灵敏度

Figure  6.  The fitting of binding constant between NBQ and HSO₃^- and the detection sensitivity

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2.3   探针NBQ对HSO₃^-的紫外-可见光响应

向探针NBQ溶液中加入不同浓度的HSO₃^-溶液(0~45.0 μmol/L)，加入HSO₃^-后发生明显的肉眼可见的颜色变化(图 7).随着HSO₃^-浓度的增大，原来在波长308 nm处的紫外吸收峰略微蓝移至271 nm处，而且吸收强度有明显的降低.另外，随着HSO₃^-浓度的增大，在波长391 nm处出现了一个强度变化不明显的新吸收峰，而在波长484 nm处的紫外吸收峰发生红移且吸收强度有明显下降.该结果与前述荧光发射光谱分析的结果一致，都说明探针与HSO₃^-发生了相互作用，影响到了探针分子的结构^[20].

图  7  向NBQ溶液中加入不同浓度HSO₃^-的紫外-可见光谱

注：NBQ溶液的浓度为20.0 μmol/L，溶剂V(DMSO)/V(H₂O)=1/4. HSO₃^-的浓度为0.0~45.0 μmol/L.插图为未加入(左)和加入45.0 μmol/L HSO₃^-后(右)探针NBQ溶液颜色的变化.

Figure  7.  The UV-Vis absorption spectra of NBQ upon addition of HSO₃^-

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为了探究环境pH对探针NBQ检测HSO₃^-的影响，采用不同pH的缓冲溶液进行优化实验(图 8).在pH 7.0~8.5范围内荧光强度变化最明显，因此，选择pH 7.4作为检测HSO₃^-的实验条件.说明探针NBQ能够在生理pH范围内对HSO₃^-进行检测，为该探针在生物内检测HSO₃^-的应用奠定了基础.

图  8  不同pH对探针NBQ缓冲溶液在加入HSO₃^-后的荧光强度变化

注：NBQ溶液的浓度为20.0 μmol/L. HSO₃^-的浓度为20.0 μmol/L.

Figure  8.  The fluorescence intensity change of HSO₃^- added to probe NBQ buffer solution at different pH values

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2.5   探针NBQ与HSO₃^-的结合模型

通过之前的实验结果可知，探针与HSO₃^-以物质的量之比为1:1进行结合，根据探针NBQ的分子结构与文献推测^[21-23]，当NBQ在溶液中处于自由态时，其受体基团的HOMO轨道上的电子能够向荧光基团的HOMO轨道上转移，致使荧光基团LOMO轨道上的激发态电子不能跃迁回到基态，从而使荧光团荧光猝灭(图 9).但是当加入HSO₃^-并与探针NBQ结合后，受体基团的HOMO轨道能量降低，其轨道上的基态电子不能再次转移到荧光团的HOMO轨道上，从而阻断了PET(光诱导电子转移)的过程，使荧光基团LOMO轨道上的激发态电子可以回到HOMO轨道，电子从激发态到基态，以荧光辐射的方式释放能量，从而荧光基团产生较强的荧光发射峰.如图 9所示，HSO₃^-与探针分子上肼基和咪唑的氮原子通过氢键结合，使体系的PET过程受阻，从而使其出现荧光增强的现象.

图  9  探针NBQ与HSO₃^-的结合示意图

Figure  9.  The potential model of the response of probe NBQ to HSO₃^-

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3.   结论

以4-氯-7-硝基苯并呋咱为荧光基团，咪唑-4-甲醛为识别基团将两者结合，合成了一种低检出限的新型荧光探针:4-硝基-7-(2-(1-亚甲基咪唑)肼基)苯并呋咱，并通过核磁共振氢谱、质谱表征了该分子的结构.实验表明：NBQ能够对水溶液中的亚硫酸氢钠有良好的识别作用，在可见光照下颜色由黄绿色变为淡橙红色，在紫外光光照下有淡红色的荧光，有良好的比色效应，NBQ在DMSO水溶液中能对HSO₃^-有非常明显的荧光增强响应，而且有很强的离子选择性和抗干扰性.同时NBQ与HSO₃^-的结合比为1:1(物质的量之比)，两者之间能够形成较强的分子间作用力.由于该探针具有较宽的pH范围检测条件，而且在中性溶液体系中性能表现良好，表明该探针能够为水环境中对HSO₃^-的检测提供一个有效途径，有望能被应用于生物体内HSO₃^-的检测.