一种可富集Fe<sup>3+</sup>的含芘荧光探针

王莎; 黄子杰; 肖盈希; 卢博; 唐健; 马立军

doi:10.6054/j.jscnun.2020091

一种可富集Fe³⁺的含芘荧光探针

华南师范大学化学学院，广州 510006

基金项目:

广东省自然科学基金项目 2015A030313392

广州市科技计划项目 201804010465

详细信息

通讯作者:
马立军，副教授，Email:mlj898021@scnu.edu.cn

中图分类号: O65
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出版历程
- 收稿日期: 2019-09-24
- 网络出版日期: 2021-01-04
- 刊出日期: 2020-12-24

A Pyrene-containing Fluorescent Probe with Enriching Fe³⁺

School of Chemistry, South China Normal University, Guangzhou 510006, China

摘要

摘要: 以芘为荧光发射基团、以邻氨基苯甲酸基团为识别基团，设计、合成了一种对Fe³⁺特异性响应的荧光探针芘甲酰邻氨基苯甲酸(PAA).利用氢核磁共振波谱、质谱表征其结构，通过紫外-可见吸收光谱以及荧光发射光谱研究其对Fe³⁺的响应性能.结果表明：PAA对Fe³⁺具有高选择性、高抗干扰性的荧光响应.随着Fe³⁺浓度的升高，探针的荧光强度逐渐减弱，同时伴随大量Fe³⁺螯合物沉淀的析出，从而使Fe³⁺从体系中富集出来，且在4倍浓度干扰离子存在的体系中，PAA对Fe³⁺的识别能力几乎不受影响.因此，PAA在实际环境应用中，具有较大的潜力和应用价值.
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- 芘 /
- Fe³⁺ /
- 环境应用 /
- 富集
Abstract: A fluorescent probe (pyrene-formyl-anthranilic acid, PAA) with specific response to Fe³⁺ was designed and synthesized using pyrene as a fluorescent group and anthranilic acid group as a receptor. The structure was characterized with hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrometry. Visible absorption spectra and fluorescence emission spectra were used to study the response of Fe³⁺. The results showed that PAA had high selectivity and high anti-interference fluorescence response to Fe³⁺. With the increase of Fe³⁺ concentration, the probe's fluorescence intensity was gradually weakened, and a large amount of iron ion chelate precipitated and so that it could be removed from the system. In the system where 4 times of interfering ions existed, the ability of PAA to recognize Fe³⁺ was hardly affected. Therefore PAA has a great potential for practical application.
- fluorescent probe /
- pyrene /
- Fe³⁺ /
- environmental application /
- enrichment

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铁(Fe)是人体中一种不可缺少的化学元素，在很多生命活动中扮演重要角色^[1-2]. Fe主要以亚铁离子(Fe²⁺)的形式存在于血红蛋白中^[3]，结合并运输血液中的氧(O).当人体内Fe含量过低时，会产生贫血症状，延缓智力发育和改变心理活动行为，造成免疫力下降等危害^[4-6].当Fe含量过高时，又会给人体带来一系列的生理紊乱现象，如在人的肝脏中大量积累时，不仅会诱导肝硬化，还会使脂质的过氧化反应活性增强，打破人体内氧化、抗氧化体系的平衡^[7-9].因此，检测和维持人体内Fe含量处于相对适宜的范围，对生理过程的正常进行且有重要意义.

目前，检测Fe³⁺浓度的方法有电化学、原子吸收光谱、等离子体发射光谱、生物和纳米传感及荧光探针等方法^[10-12].与众多检测方法相比，荧光探针法具有高选择性、高灵敏度、强的抗干扰能力、制样简便快捷、可实时原位检测等优点^[13-15].本文选择具有高荧光发射强度的芘作为荧光基团，通过生成酰胺键，与邻氨基苯甲酸结合，获得一种具有一定亲疏水性能的荧光探针芘甲酰邻氨基苯甲酸(PAA), 羧基可提高其水溶性，同时也作为金属离子的结合位点.探针与离子结合后，空间构型发生转变，导致亲水性的羧基与离子结合，整个探针分子疏水性增强，能从水溶液中析出，从而具有富集金属离子的能力.

1. 实验部分

1.1 实验仪器和试剂

主要仪器：荧光分光光度计(F-2500，日本岛津，溶液样品所采用的激发波长均为340 nm)、紫外-可见分光光谱仪(UV-1700，日本岛津)、氢核磁共振波谱仪(NMR Systems 400 MHz，美国瓦里安)、液相色谱-质谱联用仪(LCQ Deca XP MAX, 美国安捷伦)、紫外分析仪(ZF5型手提式，金坛市宏华仪器厂); pH计(PHS-3B，上海精科).

主要试剂：邻氨基苯甲酸、芘甲醛、石油醚、二氯亚砜(DMSO)、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、无水甲醇、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、柠檬酸、碳酸钠、AlCl₃、CdCl₂、BaCl₂、CoCl₂、Cr(NO₃)₃、CuCl₂、HgCl₂、FeCl₃、Pb(NO₃)₂、NiCl₂等，均为分析纯，无需进一步处理.实验用水为去离子水.

1.2 探针的合成与表征

1.2.1 PAA的合成

利用芘甲酸和邻氨基苯甲酸合成PAA, 其合成路线如图 1所示，分为2个步骤.

图 1 PAA的合成路线

Figure 1. The synthesis route of PAA

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(1) 芘甲酰氯的合成.将二氯亚砜逐滴加入芘甲酸的二氯甲烷溶液中，加热至40 ℃，回流搅拌7 h.将产物通过减压蒸馏除去溶剂，得到芘甲酰氯.

(2) PAA的合成.将新制芘甲酰氯和邻氨基苯甲酸分别溶解于二氯甲烷中，利用恒压漏斗，将芘甲酰氯溶液逐滴加入到邻氨基苯甲酸溶液中，在室温下搅拌24 h.用去离子水洗涤3次，得到粗产物，分离有机相并用无水硫酸镁进行干燥，减压过滤得到滤液.旋干滤液后，用二氯甲烷和乙酸乙酯(体积比为1 : 1)作洗脱剂，采用硅胶柱层析进一步分离提纯，最终得到PAA.

1.2.2 PAA的表征

如图 2A所示，PAA的¹H NMR图谱(500 MHz，DMSO-d₆)的化学位移和对应的质子类型归属：13.68 (s, 1H, -COOH-), 8.17~7.28 (m, 4H, 12.05 (s, 1H, -CONH-), 8.80~8.29 (m, 9H, pyrene(H)), benzene(H)). ESI-MS(甲醇做溶剂)：分子式C₂₄H₁₅NO₃，理论计算的相对分子质量为365.11，实验测试结果为364.00(图 2B).

图 2 PAA的¹H NMR及质谱图

Figure 2. The ¹H NMR and ESI-MS spectra of PAA

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2. 结果与讨论

2.1 PAA识别Fe³⁺的光谱变化

图 3A为PAA溶液(20.0 μmol/L)的紫外-可见吸收光谱，在波长分别为277 nm和345 nm附近有2个强的吸收峰，这是芘的特征吸收峰.随着滴加Fe³⁺浓度的逐渐增大，PAA溶液的2个吸收峰强度明显减弱，这说明Fe³⁺与PAA发生了相互作用.

图 3 PAA溶液中加入不同浓度Fe³⁺时的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱

注：图B中插图为在波长为365 nm的紫外灯照射下，探针分子PAA对Fe³⁺响应的照片，其中a溶液c(PAA)=20.0 μmol/L, b溶液中c(PAA)=20.0 μmol/L，c(Fe³⁺)=120.0 μmol/L.

Figure 3. The fluorescence emission spectra and UV-Vis spectra of PAA upon addition of various amounts of Fe³⁺

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在激发波长340 nm、pH 4.00条件下，含DMSO体积分数为5%的PAA水溶液(20.0 μmol/L)在波长495 nm处有1个强的荧光发射峰(图 3B).根据文献[16]，该峰是芘的聚集发射峰.向PAA水溶液中加入不同浓度的Fe³⁺溶液，发现波长为495 nm处的聚集发射峰强度随着Fe³⁺浓度的增大而降低，这表明PAA与Fe³⁺之间发生了结合，具有荧光识别的响应特性.与此同时，还观察到白色絮状沉淀从溶液中析出，在波长为365 nm的紫外灯下，溶液从绿色逐渐变成无色(图 3B插图a、b). Fe³⁺的存在使探针水溶液发生了荧光猝灭现象，并且Fe³⁺可以与PAA结合形成沉淀，从而达到富集Fe³⁺的目的.因此，PAA对Fe³⁺具有检测、富集双重功能.

2.2 PAA识别Fe³⁺的选择性和抗干扰性能

在相同条件下，向PAA水溶液中分别加入浓度为30.0、60.0、90.0、120.0 μmol/L的Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Fe²⁺等7种常见重金属离子溶液后，测试激发波长为495 nm时的荧光发射光谱(图 4A).以荧光强度的相对变化值(I-I₀)/I₀作为参考指标，只有滴加Fe³⁺时才能使PAA溶液的荧光发射峰强度产生明显变化，而对于其他离子，即使浓度较高，也不会产生白色絮状沉淀物，只出现相当微弱的荧光猝灭.该现象进一步说明了PAA对Fe³⁺具有高选择性的富集能力和荧光识别响应，因此，PAA可作为Fe³⁺的荧光探针.

图 4 不同金属离子浓度对PAA荧光发射峰强度的影响及其干扰性

注：图A中c(PAA)=20.0 μmol/L, 发射峰中心波长为495 nm.图B为在PAA(20.0 μmol/L)水溶液中，单独添加Fe³⁺浓度(30.0 μmol/L)及同时添加Fe³⁺(30.0 μmol/L)和竞争离子(150.0 μmol/L)时溶液荧光发射强度的相对变化.

Figure 4. The effects of different metal ion concentrations on the intensity of PAA fluorescence emission peaks and their interference

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为了证明PAA具有特异性识别Fe³⁺的应用潜力，考察实际水样中当其他金属离子存在时，PAA对Fe³⁺的识别和富集是否受到干扰，即同时向PAA水溶液中加入Fe³⁺与其他金属离子.当其他金属离子的浓度为Fe³⁺浓度(30.0 μmol/L)的5倍时，只有Cr³⁺和Cd²⁺能够使探针溶液的荧光发射峰强度发生极其微弱的增强，对其他金属离子(如Cu²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺等)几乎没有任何影响(图 4B).这说明PAA在水溶液中对Fe³⁺的识别具有很强的抗干扰能力.

2.3 PAA与Fe³⁺的结合比和结合常数

为了探究Fe³⁺与PAA的结合模式，进行滴定实验.控制PAA与Fe³⁺的总浓度为20.0 μmol/L，调节PAA与Fe³⁺的浓度之比并测试荧光强度，计算波长为495 nm的荧光强度在Fe³⁺加入前后的差值(I₀-I)对Fe³⁺所占浓度比c(Fe³⁺)/[c(Fe³⁺)+c(PAA)]作图，即得Job's plot图(图 5A)，由图中最大值对应的横坐标0.3可近似测算，PAA与Fe³⁺形成稳定螯合物时PAA与Fe³⁺的最佳结合比(物质的量之比)为2 : 1, 即2个PAA分子可结合1个Fe³⁺形成稳定的络合物.

图 5 不同离子探针比例对PAA荧光发射峰强度的影响及其在最佳结合模式下的拟合曲线

注：图A中PAA与Fe³⁺在水溶液中的总浓度为20.0 μmol/L; 最佳结合模式n(PAA) : n(Fe³⁺)=2:1.

Figure 5. The effect of different ion probe ratios on the intensity of PAA fluorescence emission and its fitting in the best binding mode

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结合文献的方法，利用Levenberg-Marquardt algorithm^[17]进行曲线拟合，以波长为495 nm处荧光强度的差值比(I-I₀)/(I_min-I₀)表示PAA的残余浓度，利用反应式和公式

$2\text{H}+\text{G}\rightleftharpoons \text{G}{{\text{H}}_{2}}\left( {{\mathit{K}}_{21}} \right)$

(1)

$\mathit{c}({\rm{F}}{{\rm{e}}^{3 + }}) = \frac{a}{{2{K_{21}}{{(1 - a)}^2}c({\rm{PAA}})}} + \frac{{ac({\rm{PAA}})}}{2}$

(2)

进行非线性拟合，其中G代表Fe³⁺，H代表PAA，a为常数，K₂₁是PAA与Fe³⁺的拟合常数.通过拟合结果计算得到PAA与Fe³⁺的结合常数K₂₁高达3.075×10¹²(图 5B)，说明探针分子PAA和Fe³⁺之间的结合非常稳定.

以上结果表明：1个Fe³⁺离子能够与2个PAA分子结合形成沉淀.该结果与实验预期一致，都显示了探针分子上唯一的结合位点——邻氨基苯甲酸上的羧基与Fe³⁺的结合作用产生了沉淀，1个Fe³⁺与2个探针分子中极性较大的羧基结合，提高了Fe³⁺-探针复合物的疏水性能，从溶液体系中析出，产生荧光猝灭现象，即荧光识别响应.

3. 结论

以芘为荧光发射基团、邻氨基苯甲酸基为识别基团，合成了一种对Fe³⁺具有高选择性荧光识别作用的水溶性荧光探针——芘甲酰邻氨基苯甲酸.在含DMSO体积分数为5%的水溶液中，对Fe³⁺表现出荧光猝灭现象，且产生絮状沉淀，实现了同时对目标离子产生荧光识别响应和富集作用.该探针表现出高灵敏性、高选择性、强抗干扰能力和多功能性，具有一定的应用潜力.

图 1 PAA的合成路线

Figure 1. The synthesis route of PAA

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图 2 PAA的¹H NMR及质谱图

Figure 2. The ¹H NMR and ESI-MS spectra of PAA

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图 3 PAA溶液中加入不同浓度Fe³⁺时的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱

注：图B中插图为在波长为365 nm的紫外灯照射下，探针分子PAA对Fe³⁺响应的照片，其中a溶液c(PAA)=20.0 μmol/L, b溶液中c(PAA)=20.0 μmol/L，c(Fe³⁺)=120.0 μmol/L.

Figure 3. The fluorescence emission spectra and UV-Vis spectra of PAA upon addition of various amounts of Fe³⁺

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图 4 不同金属离子浓度对PAA荧光发射峰强度的影响及其干扰性

注：图A中c(PAA)=20.0 μmol/L, 发射峰中心波长为495 nm.图B为在PAA(20.0 μmol/L)水溶液中，单独添加Fe³⁺浓度(30.0 μmol/L)及同时添加Fe³⁺(30.0 μmol/L)和竞争离子(150.0 μmol/L)时溶液荧光发射强度的相对变化.

Figure 4. The effects of different metal ion concentrations on the intensity of PAA fluorescence emission peaks and their interference

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图 5 不同离子探针比例对PAA荧光发射峰强度的影响及其在最佳结合模式下的拟合曲线

注：图A中PAA与Fe³⁺在水溶液中的总浓度为20.0 μmol/L; 最佳结合模式n(PAA) : n(Fe³⁺)=2:1.

Figure 5. The effect of different ion probe ratios on the intensity of PAA fluorescence emission and its fitting in the best binding mode

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期刊类型引用(1)

苏仙桃，杨浩，张曼. ClO~-识别的稀土荧光探针的合成及性能研究. 赤峰学院学报(自然科学版). 2021(12): 10-14 .

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1. 实验部分
1.1 实验仪器和试剂
1.2 探针的合成与表征
1.2.1 PAA的合成
1.2.2 PAA的表征
2. 结果与讨论
2.1 PAA识别Fe3+的光谱变化
2.2 PAA识别Fe3+的选择性和抗干扰性能
2.3 PAA与Fe3+的结合比和结合常数
3. 结论

一种可富集Fe3+的含芘荧光探针

通讯作者: 马立军，副教授，Email:mlj898021@scnu.edu.cn

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