Mechanism of Ephedra-Guizhi in Treatment of Rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking
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摘要: 通过TCMSP数据库检索麻黄、桂枝中的活性成分以及对应的靶点蛋白，在GeneCards数据库中以“rheumatoid arthritis”为关键词检索类风湿性关节炎(RA)的相关靶点，将收集的2类靶点相互映射取交集后通过STRING平台构建PPI网络，利用Cytoscape软件进行可视化分析；借助David 6.8数据库，对交集靶点进行GO与KEGG富集分析；最后利用Schrodinger软件对核心靶点与关键活性成分进行分子对接验证。2类靶点映射得到交集靶点共134个，PPI分析得到核心靶点为AKT1、IL6、TP53、RELA和CCND1。GO与KEGG富集分析得到关键信号通路为TNF信号通路、Toll样受体信号通路和PI3K-Akt信号通路。分子对接结果显示槲皮素、木犀草素、二氢槲皮素与AKT1、IL6、TP53有较好的结合效果。研究推测麻黄-桂枝药对中的活性成分可能通过抑制炎性介质表达、抑制关节滑膜中树突细胞以及巨噬细胞过量增殖等途径来阻止RA病理发展进程。Abstract: The active components and corresponding target proteins in Ephedra and Guizhi were retrieved through TCMSP database, and Rheumatoid Arthritis(RA) related targets were retrieved with "rheumatoid arthritis" as the keyword in GeneCards database. After the collected two types of targets were mapped and intersected with each other, PPI network was constructed through STRING platform, and visual analysis was carried out by Cytoscape software. At the same time, the intersection targets were enriched and analyzed by GO and KEGG with the help of David 6.8 database. Finally, the core target and key active components were docking verified by Schrodinger software. Two kinds of targets are mapped, there are 134 intersection targets. PPI analysis shows that the core targets are AKT1, IL6, TP53, RELA and CCND1. Go and KEGG enrichment analysis showed that the key signal pathways were TNF signal pathway, Toll like receptor signal pathway and PI3K-Akt signal pathway. Molecular docking results showed that quercetin, luteolin and dihydroquercetin had good binding effects with AKT1, IL6 and TP53. It is concluded that the active components of Ephedra-Guizhi may play a role in the treatment of rheumatoid arthritis by inhibiting the expression of inflammatory mediators and suppressing the excessive proliferation of dendritic cells and macrophages in joint synovium to prevent pathological progression of RA.
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类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，患病率约占世界总人口的1%[1]。RA发病的起始部位是关节滑膜，滑膜成纤维细胞是RA炎症反应的主要效应细胞之一，其与T细胞的相互作用是参与RA发病的主要机制。RA通常会导致一些临床症状，如关节发热、肿胀和疼痛，RA晚期患者的骨关节变形破坏严重，有着较高的致残率[2-3]。目前针对RA治疗的一线药物包括抗风湿药、糖皮质激素和生物制剂等。化学药物治疗可以很快地缓解症状，但其毒副作用给身体带来很大的负担，而生物制剂等药物价格又十分昂贵。
RA在中医上属“痹症”，中医在治疗痹症上有着丰富的经验。中医认为RA是由于体质虚弱、气血两虚、肝肾亏损和风寒湿邪侵袭，使得筋脉痹阻[4]。麻黄-桂枝药对源于经典名方麻黄汤。草麻黄(麻黄)和云母肉桂(桂枝)作为君药和臣药相互促进，以3 ∶ 2的质量比组合后，可用于治疗气喘、鼻子及肺部充血、发烧多汗症和关节痛等风寒表实证者[5]。同时麻黄与桂枝均具有抗炎活性，桂枝还可协同麻黄发挥抗炎效果。另外，麻黄附子细辛汤合桃红四物汤加味与甲氨蝶呤联用，可有效缓解关节肿胀、关节疼痛和晨僵等临床症状[6]。有研究[7]表明，槲皮素作为麻黄的主要活性成分可下调体内TNF-α，从而促进伤口愈合并阻止体内炎症级联反应。麻黄附子细辛汤可降低树突状细胞表面共刺激因子和Th1型细胞因子的表达水平，从而抑制LPS诱导的树突状细胞分化成熟[8]。桂枝芍药知母汤在临床上也被用于治疗RA，在与甲氨蝶呤联合用药后，C反应蛋白表达量、类风湿性因子含量及红细胞沉降率均明显降低[9]。将桂枝芍药知母汤用于大鼠Ⅱ型胶原性关节炎模型中发现，其降低了大鼠脚趾肿胀、关节炎评分及血清TNF-α、IL1β、IL6、IL17a水平，体外细胞实验表明桂枝芍药知母汤能上调Caspase-3、Caspase-9、Bax和SOCS1的mRNA表达，且下调Bcl-2、JAK2、STAT3和STAT5的mRNA表达，进而显著抑制TNF-α刺激的MH7A细胞的增殖且促进其凋亡[10]。
本研究基于网络药理学方法，从中药复方多组分、多靶点和多效应的作用特点出发，依据RA致病机制，探究麻黄-桂枝药对中的活性成分治疗RA的机制。研究整合了麻黄-桂枝药对中的活性组分与RA相关通路之间的信息，利用网络药理学的研究方法弥补了单成分、单靶点、单通路研究的不足，为从多靶点、多途径阐述麻黄-桂枝药对治疗RA的作用机制提供了可能。最后，采用分子对接方法分析了中药活性成分潜在的治疗靶点，以期为RA治疗提供理论依据。
1. 实验方法
1.1 麻黄-桂枝有效成分及靶点筛选
运用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)分别检索麻黄与桂枝中的有效成分，检索有效成分时设置口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18。同时，对有效成分的候选靶蛋白在TCMSP平台进行全方位检索。将数据制成表格，利用Cytoscape 3.8软件进行视图分析，并绘制药材-有效成分-靶点网络图。
1.2 类风湿性关节炎相关靶点检索
在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中，以“rheumatoid arthritis”为关键词，检索RA的相关靶点。利用Venny 2.1.0软件将RA相关靶点映射到有效成分候选靶点，并取二者的交集绘制韦恩图。将交集靶点对应的有效化合物进行统计，然后利用Cytoscape 3.8软件计算其相关拓扑数据并构建药材成分-交集靶点网络图。
1.3 交集靶点PPI分析
为了进一步明确交集靶点在RA治病机理的蛋白-蛋白相互作用(PPI)，将交集靶蛋白的Gene ID导入STRING数据库(https://string-db.org/)，模式选择“multiple proteins”，蛋白种属设为“homo sapiens”，筛选条件为“medium confidence(0.900)”，得到交集靶点相互作用网络数据，并将该数据导入Cytoscape 3.8软件，从而制作蛋白互作(PPI)网络图。对PPI网络图进行相关的拓扑数据分析后，依据Cytoscape 3.8软件中的degree值选取关键靶蛋白。
1.4 KEGG通路富集分析和GO富集分析
了解核心靶蛋白的生物功能以及参与的信号通路，对从分子机制上分析麻黄-桂枝药对治疗RA是十分关键的。将核心靶蛋白的Gene ID导入David 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，对核心靶点蛋白在生物过程(Biological Process, BP)、细胞组分(Cellular Component, CC)、分子功能(Molecular Function，MF)方面的作用机制以及KEGG通路富集进行分析。
1.5 构建药材-成分-靶点-信号通路网络图
将核心靶点及其对应的化合物、信号通路的数据导入Excel表格，对数据进行整理后导入Cytoscape 3.8软件进行视图分析，从而绘制药材-成分-靶点-信号通路网络图。对网络图进行拓扑数据分析后，依据Cytoscape 3.8软件中的degree值选取在关键通路中发挥作用的核心靶点, 然后对核心靶点及核心化合物进行分子对接实验。
1.6 分子对接
所有核心蛋白的晶体结构均从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取，本次模拟分析均在Schrödinger 2019软件中完成。在“Protein preparation wozard”模块下对蛋白晶体结构进行预处理，包括加氢、添加缺失的氨基酸残基以及对蛋白结构进行能量最小化。在Glide模块中，为了确保对接准确性，选取对接精度为精确对接(XP)，定义活性口袋方法均采用配体扩张法，以蛋白晶体结构中共晶化合物所在蛋白口袋为活性位点，对接方式采取半柔性对接，通过对接分数值(Docking score)来判断活性成分与靶点之间是否存在潜在的阳性作用。在对接实验前，在Glide模块中对共晶化合物进行重对接，将对接产生的构象与原晶体构象叠合后计算均方根偏差(RMSD)。若RMSD数值小于0.2 nm，则证明对接方法较合理[11]。
2. 结果与分析
2.1 麻黄-桂枝药对中的活性成分及靶点的筛选结果
在TCMSP数据平台上分别对麻黄与桂枝中的活性成分进行筛选，麻黄中符合筛选条件的化合物共22个(MH1~MH19，A1~A3)，桂枝中符合筛选条件的化合物共6个(GZ1~GZ3，A1~A3)，2种药材中的共同活性成分有3个(A1~A3)，由此确认麻黄-桂枝药对中的活性成分共25个(表 1)，检索到对应候选靶点229个，由此绘制药材-活性成分-靶点网络图(图 1)。
表 1 麻黄-桂枝药对中的活性成分Table 1. Active ingredients in Ephedra-Guizhi drug pairMOL ID 来源 代号 化合物 OB/% DL MOL010788 麻黄 MH1 leucopelargonidin 57.97 0.24 MOL002823 麻黄 MH2 herbacetin 36.07 0.27 MOL010489 麻黄 MH3 resivit 30.84 0.27 MOL000422 麻黄 MH4 kaempferol 41.88 0.24 MOL004798 麻黄 MH5 delphinidin 40.63 0.28 MOL000098 麻黄 MH6 quercetin 46.43 0.28 MOL000006 麻黄 MH7 luteolin 36.16 0.25 MOL000449 麻黄 MH8 stigmasterol 43.83 0.76 MOL001494 麻黄 MH9 mandenol 42.00 0.19 MOL001755 麻黄 MH10 24-Ethylcholest-4-en-3-one 36.08 0.76 MOL001771 麻黄 MH11 poriferast-5-en-3beta-ol 36.91 0.75 MOL002881 麻黄 MH12 diosmetin 31.14 0.27 MOL004328 麻黄 MH13 naringenin 59.29 0.21 MOL005043 麻黄 MH14 campest-5-en-3beta-ol 37.58 0.71 MOL005190 麻黄 MH15 eriodictyol 71.79 0.24 MOL005573 麻黄 MH16 genkwanin 37.13 0.24 MOL005842 麻黄 MH17 pectolinarigenin 41.17 0.30 MOL007214 麻黄 MH18 (+)-Leucocyanidin 37.61 0.27 MOL011319 麻黄 MH19 truflex OBP 43.74 0.24 MOL001736 桂枝 GZ1 (-)-taxifolin 60.51 0.27 MOL000359 桂枝 GZ2 sitosterol 36.91 0.75 MOL000073 桂枝 GZ3 ent-Epicatechin 48.96 0.24 MOL000358 麻黄/桂枝 A1 beta-sitosterol 36.91 0.75 MOL000492 麻黄/桂枝 A2 (+)-catechin 54.83 0.24 MOL004576 麻黄/桂枝 A3 taxifolin 57.84 0.27 注：OB为口服生物利用度，DL为类药性。 ![]()
图 1 药材-活性成分-靶点网络注：节点大小以及透明度依据degree值区分。Figure 1. The network of medicinal materials-active ingredients-targets2.2 RA相关靶点的检索
在GeneCards数据库中，以“rheumatoid arthritis”为关键词，检索得到与RA相关的靶蛋白共4 466个。根据GeneCards数据库中的“Relevance score”值可判断靶蛋白与RA的相关性，为精减靶蛋白的数量，方便后续处理并提高靶蛋白与RA的相关性，选择“Relevance score”不小于中位数的靶蛋白用于后续处理。计算得到“Relevance score”的中位数为1.44，最终筛选到“Relevance score”不小于1.44的靶蛋白共2 046个。将麻黄-桂枝药对中的活性成分对应的候选靶点与RA相关靶蛋白进行相互映射取交集，如韦恩图(图 2)所示，共有134个交集靶蛋白。取这些交集靶蛋白对应的化合物绘制交集靶点-化合物网络图(图 3)，共得到161个节点和373条边，平均degree值为5；然后利用Cytoscape 3.8软件对网络图拓扑数据进行分析。网络图中degree值高于平均degree值的节点共有26个，其中含有13个活性成分：MH6(槲皮素，degree=102)、MH7(木犀草素，degree=47)、A1(β-谷甾醇，degree=43)、MH4(山奈酚，degree=43)、MH13(柚皮苷，degree=24)、A3(二氢槲皮素，degree=16)、A2(儿茶素，degree=14)、MH8(豆甾醇，degree=13)、MH2(除草素，degree=8)、MH16(芫花素，degree=8)、MH5(花翠素，degree=7)、MH17(柳穿鱼黄素，degree=6)和MH12(香叶木素，degree=6)。
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图 2 麻黄-桂枝药对中的活性成分对应的候选靶点与RA相关靶点映射交集Figure 2. The intersection mapping of candidate targets corresponding to active ingredients in Ephedra-Guizhi drug pair and RA related targets![]()
图 3 麻黄-桂枝药对中的活性成分-交集靶点网络注：图中左侧为活性成分，右侧为交集靶点。Figure 3. The network of active ingredients in Ephedra-Guizhi drug pair-intersection targets2.3 靶点蛋白相互作用(PPI)网络图
在STRING平台中导入134个交集靶蛋白，进行蛋白-蛋白互作模式(PPI)分析。将数据导入Cytoscape 3.8软件中进行视图分析。由结果(图 4)可知：PPI网络图共有109个节点、600条边。靶蛋白的degree值分布在[1, 48]范围内，其中degree>25的靶蛋白共8个: TP53(degree=48)、JUN(degree=45)、AKT1(degree=42)、IL6(degree=33)、FOS(degree=33)、RELA(degree=32)、EGFR(degree=27)和CCND1(degree=26)，这些关键靶蛋白可能在使用麻黄-桂枝药对治疗类风湿性关节中发挥着重要的作用。
2.4 GO生物信息学分析和KEGG信号通路富集分析
将134个交集靶点导入David数据库进行功能注释分析(GO分析)，包括生物过程(BP)、细胞组成(CC)和分子功能(MF)3个方面。GO分析共获得821个条目，依据P值(P < 0.01)以及靶蛋白富集数(Count)选取排名前10的条目进行可视化处理。可视化结果(图 5A)显示：交集靶蛋白在生物过程中主要涉及对药反应、细胞凋亡过程的负性调节、脂多糖的反应和炎症应答等过程，在细胞组成方面主要参与细胞外间隙、细胞溶质、胞外区域、细胞表面等过程，在分子功能方面主要涉及酶的结合、相同蛋白结合、蛋白质同聚活性、细胞因子活性和蛋白结合等过程。
对交集靶点进行KEGG富集分析，在David数据库中共检索得到127个信号通路，选取P＜0.01且富集数排名前20的信号通路。通路富集图分析结果(图 5B)表明：交集靶点主要参与肿瘤相关通路(Pathways in cancer)、慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、乙型肝炎(Hepatitis B)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)和PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。排名前20的信号通路的富集数、P值、关键靶点如表 2所示。
表 2 排名前20的信号通路Table 2. The information of top 20 pathways编号 信号通路 靶蛋白富集数/个 P值 关键靶点 1 Hepatitis B 35 2.35E-29 TP53、JUN、AKT1、FOS、IL6、RELA、CCND1 2 Pathways in cancer 50 3.13E-29 TP53、JUN、AKT1、FOS、IL6、RELA、EGFR、CCND1 3 Bladder cancer 20 4.19E-23 TP53、EGFR、CCND1 4 Pancreatic cancer 23 5.62E-23 TP53、AKT1、RELA、EGFR、CCND1 5 TNF signaling pathway 25 2.92E-20 JUN、AKT1、FOS、IL6、RELA 6 Prostate cancer 22 2.06E-18 TP53、AKT1、RELA、EGFR、CCND1 7 Chagas disease (American trypanosomiasis) 23 4.88E-18 JUN、AKT1、FOS、IL6、RELA 8 Chronic myeloid leukemia 20 1.24E-17 TP53、AKT1、RELA、CCND1 9 Toxoplasmosis 22 2.76E-16 AKT1、RELA 10 Glioma 18 8.37E-16 TP53、AKT1、EGFR、CCND1 11 Proteoglycans in cancer 27 1.13E-15 TP53、AKT1、EGFR、CCND1 12 Non-small cell lung cancer 17 1.32E-15 TP53、AKT1、EGFR、CCND1 13 HIF-1 signaling pathway 20 4.25E-15 AKT1、IL6、RELA、EGFR 14 Colorectal cancer 17 8.17E-15 TP53、JUN、AKT1、FOS、CCND1 15 Toll-like receptor signalingpathway 20 2.93E-14 JUN、AKT1、FOS、IL6、RELA 16 Melanoma 17 8.37E-14 TP53、AKT1、EDFR、CCND1 17 Small cell lung cancer 18 1.1E-13 TP53、AKT1、RELA、CCND1 18 PI3K-Akt signaling pathway 31 3.32E-13 TP53、AKT1、IL6、RELA、EGFR、CCND1 19 Influenza A 23 4.15E-13 JUN、AKT1、IL6、RELA 20 Leishmaniasis 16 1.45E-12 JUN、FOS、RELA 2.5 麻黄-桂枝“活性成分-靶点-信号通路”网络图构建
依据KEGG分析结果，统计关键靶点-信号通路、化合物-靶点信息。将统计的数据导入Cytoscape 3.8软件中，建立“活性成分-靶点-信号通路”网络图(图 6)。该网络图包含34个节点、119条边。网络图显示：MH6(槲皮素)、MH7(木犀草素)、MH4(山奈酚)、MH13(柚皮苷)、A3(二氢槲皮素)和A1(β-谷甾醇)作为活性成分作用于这些关键靶点，调节相关信号通路。按照degree≥15的标准选取核心靶点，分别为AKT1(degree=22)、TP53(degree=20)、RELA(degree=20)、IL6(degree=18)和CCND1(degree=15)，提示麻黄-桂枝药对中的活性成分可能通过靶向于上述5个核心靶点来调节相关信号通路，以达到治疗RA的目的。
2.6 分子对接验证
将6个关键活性成分(槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮苷、二氢槲皮素和β-谷甾醇)与5个核心靶点(AKT1、TP53、RELA、IL6和CCND1)进行分子对接研究，验证这些活性成分是否有直接作用于核心靶点的可能。从PDB数据库中获取核心靶点的晶体结构：TP53(PDB ID：6GGC)、AKT1(PDB ID：4EKL)、IL6(PDB ID：4CNI)、RELA(PDB ID：6NV2)和CCND1(PDB ID：6P8G)。在对接实验之前，对共晶化合物进行了重对接，比较对接生成的配体构象与原配体晶体构象的RMSD值。结果显示所有RMSD数值均小于0.2 nm(TP53：0.032 nm、AKT1：0.056 nm、RELA：0.137 nm)，证明Glide对接程序可确保对接实验的准确性。关键活性成分与核心靶点的对接分数(表 3)显示：活性成分中槲皮素(MH6)、木犀草素(MH7)、二氢槲皮素(A3)与5个核心靶点中的AKT1、TP35、IL6的对接分数较高。
表 3 关键活性成分与5个核心靶点的对接分数Table 3. Docking information of key active ingredients and five core targets化合物 结构 CAS号 对接分数/(kcal·mol-1) TP53 AKT1 IL6 RELA CCND1 槲皮素 
117-39-5 -8.119 -7.243 -6.321 -5.317 -5.364 木犀草素 
491-70-3 -8.713 -7.537 -6.452 -5.428 -5.412 二氢槲皮素 
480-18-2 -8.442 -7.738 -5.341 -5.786 -5.874 山奈酚 
25615-14-9 -6.493 -7.231 -3.698 -5.228 -5.012 柚皮苷 
158196-34-0 -7.430 -7.193 -3.514 -5.661 -4.312 β-谷甾醇 
83-46-5 -5.700 -5.241 -3.574 -4.657 -3.162 为了探究槲皮素、木犀草素以及二氢槲皮素是否可作为AKT1、TP53及IL6靶点的潜在抑制剂，结合蛋白-配体对照组AKT1-GDC0068、TP53-PK9320、IL6-olokizumab对3组蛋白-配体形成的复合物体系进行互作模式分析。
多数AKT1抑制剂通常不直接与磷酸酶磷酸化的2个位点(Thr308和Ser473)结合，而是作用于AKT1蛋白C末端与N末端之间的结合口袋，从而稳定蛋白构象、保护磷酸化位点[12]。对AKT1竞争性抑制剂GDC0068(对接分数为-9.210 kcal/mol)的研究(图 7A(a))发现，其与铰链区上氨基酸Glu278、Glu234、Glu228和Ala230存在氢键作用，这类相互作用模式为多数抑制剂的共同作用方式。槲皮素、木犀草素和二氢槲皮素与AKT1抑制剂的作用方式类似，羟基上的氢与铰链区氨基酸Glu228、Ala230及Asp292存在氢键作用(图 7A(b)~(d))。
在RA患者的滑膜细胞内，TP53基因在氧化应激的状态下发生了点突变。突变后，TP53蛋白量与类风湿关节炎患者关节的受侵袭程度、破坏程度呈正相关。PK9320(对接分数为-9.354 kcal/mol)作为一种TP53突变体(DNA结合位点突变) 的稳定剂，可结合于突变体的蛋白口袋, 进而稳定蛋白构象，这种结合带来的稳定效果使TP53恢复了原有功能[13]。如图 7B所示，PK9320氨基上的氢以及呋喃上的氧分别与Asp228、Cys220形成氢键作用。槲皮素与木犀草素的作用方式相似，苯环上的羟基均与Cys220、Leu145形成氢键作用，二氢槲皮素在口袋中还与Thr150、Asp228存在氢键作用。
IL6反信号传导在介导自身免疫病理中起到关键作用，调节IL6/gp130信号通路是治疗一系列疾病的有效治疗方法。奥洛昔单抗(olokizumab)通过与IL6结合来阻止IL6与gp130的结合，从而达到抑制IL6/gp130信号通路的目的，其中Trp157为IL6结合域的关键氨基酸[14]。木犀草素与槲皮素黄酮结构中的A环和与之相连的杂环与Trp157之间存在π-π共轭作用，并与Ser47、Glu51、Lys54形成氢键作用(图 7C)。
槲皮素(MH6)、木犀草素(MH7)、二氢槲皮素与AKT1、TP53、IL6的对接分数接近于阳性对照组的对接分数，其中木犀草素的对接分数更接近于阳性对照组的。
作用方式分析显示上述3个化合物均可于关键位点形成相互作用，这与成药作用模式类似，表明这3个化合物具有直接作用于3类核心靶点的潜力。
3. 讨论
RA是一种自身免疫性疾病，骨降解、软骨和骨滑膜破坏是RA病理机制的3个主要途径。树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞与自身抗原结合引起关节发炎，这些细胞可通过相关信号通路来增加白细胞介素1、6、17(IL1、IL6、IL17)等炎性因子，进一步激活骨滑膜上的免疫细胞，加重关节炎症情况[15]。RA可对除骨关节外的其他器官造成损害，其治病机理涉及诸多蛋白之间的相互作用十分复杂，从单靶点、单通路探究RA治疗机制难以取得成效。所以，结合蛋白-蛋白相互作用从多机制、多成分上探究，对治疗RA十分关键。
本研究借助网络药理学来研究麻黄-桂枝药对中的活性成分治疗RA的潜在机制。结果显示：槲皮素、木犀草素和二氢槲皮素作为主要活性成分，与核心靶点存在潜在的相互作用方式。槲皮素具有抑制炎症介质的表达和分泌、抗氧化、免疫调节的功能，可抑制关节滑膜组织细胞增生，从而缓解RA症状。SALEEM等[16]的研究表明：槲皮素可减少关节炎动物模型体内炎症的发生以及关节滑膜增生，同时可使IL6、TNF-α和NF-κB等关键炎性因子下调。木犀草素是一种类黄酮化合物，具有抗炎、免疫调节和抗氧化等活性。沈瑞明等[17]建立了急性痛风性关节炎模型，对木犀草素抗关节炎作用进行研究，发现木犀草素各剂量组造模后，各时间点的关节肿胀指数均降低。另外，木犀草素能显著降低IL1β、IL6、TNF-α的表达水平[18]。木犀草素还可通过影响核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)的信号通路来降低巨噬细胞表达炎性因子的水平，从而减少一氧化氮和促炎性类花生酸的产生[19]。ZHANG等[20]的研究表明二氢槲皮素可抑制NF-κB配体受体激活剂(RANKL)诱导的人骨髓巨噬细胞(BMM)的破骨细胞形成。在脂多糖刺激的RAW264.7细胞中，二氢槲皮素呈剂量依赖性地降低TNF-α、IL1和IL6的表达水平[21]。
分子对接实验结果显示关键活性成分槲皮素、木犀草素、二氢槲皮素可与AKT1、TP53、IL6形成较强的相互作用，且蛋白-配体间的作用模式与阳性对照药的相同。AKT1是PI3K-Akt信号通路的重要调节因子，研究表明血清TNF的升高水平是由AKT1/NF-κB信号通路介导的[22]。在被破坏性表型的滑膜成纤维细胞中，HDAC、JUN、NFKB1、TNF和TP53是调控滑膜细胞成纤维细胞侵袭性的关键调控因子[23]。IL6作为RA致病机理中的重要炎性因子，在许多病变关节滑膜细胞以及其他器官中高表达，针对IL6设计合成抑制剂一直以来是治疗RA的关键途径。
在生物功能分析中，关键靶点主要涉及对脂多糖的反应、炎症应答等过程。脂多糖在体内可刺激免疫细胞分泌炎性介质，使RA-FLS和MM-9的表达量增加，增加对关节组织的损害。KEGG分析中，交集靶点多数富集于肿瘤相关通路上，其中在TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路和Toll样受体信号通路中关键靶点均有富集。TNF信号通路在RA介导的炎症反应中起着重要的作用，可促进TNF-α表达。TNF-α是治疗RA的关键靶点，针对该靶点上市的药物，如英夫利昔单抗、依那西普和阿达木单抗等，是治疗RA的一线药物。PI3K-Akt信号通路和Toll样受体信号通路调控多种细胞过程，包括细胞增殖、细胞存活、自噬、凋亡、分化和血管生成，均涉及关节中巨噬细胞、树突状细胞和滑膜成纤维细胞的增殖表达[24]。IL17可增强成纤维样滑膜细胞中IL6和IL8的产生，而这一过程是通过激活PI3K-Akt信号通路来实现的[25]。
4. 结论
本研究首先通过TCMSP数据库检索麻黄、桂枝中的活性成分以及对应的靶点蛋白，在GeneCards数据库中以“rheumatoid arthritis”为关键词检索RA相关靶点，将收集的2类靶点相互映射取交集后通过STRING平台构建PPI网络，并利用Cytoscape软件进行可视化分析；然后借助David 6.8数据库，对交集靶点进行GO与KEGG富集分析；最后，利用Schrodinger软件对核心靶点与关键活性成分进行分子对接验证。PPI分析得到核心靶点为AKT1、IL6、TP53、RELA和CCND1。GO与KEGG富集分析得到关键信号通路为TNF信号通路、Toll样受体信号通路和PI3K-Akt信号通路。分子对接结果显示槲皮素、木犀草素、二氢槲皮素与AKT1、IL6、TP53有较好的结合效果。由此推测麻黄-桂枝药对可能是通过槲皮素、木犀草素和二氢槲皮素等关键活性物质作用于AKT1、TP53和IL6等靶点，从而抑制TNF信号通路，减少TNF-α关键炎性介质表达；同时对PI3K-Akt信号通路和Toll样受体信号通路进行调节，以抑制关节滑膜中树突细胞以及巨噬细胞过量增殖，减少细胞中IL6、IL17等炎性因子表达，从而阻止RA病理发展进程。
本研究利用网络药理学整合药物-靶点相关信息，为从多靶点多通路探讨中药治疗RA作用机制提供了参考；利用分子对接实验进一步探究多组分与多靶点之间潜在的关系，从分子机制水平上探究了麻黄-桂枝药对治疗RA可能的作用机制，为从中药中探究活性成分、核心靶点和潜在机制提供了方法。
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图 1 药材-活性成分-靶点网络
注：节点大小以及透明度依据degree值区分。
Figure 1. The network of medicinal materials-active ingredients-targets
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图 2 麻黄-桂枝药对中的活性成分对应的候选靶点与RA相关靶点映射交集
Figure 2. The intersection mapping of candidate targets corresponding to active ingredients in Ephedra-Guizhi drug pair and RA related targets
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图 3 麻黄-桂枝药对中的活性成分-交集靶点网络
注：图中左侧为活性成分，右侧为交集靶点。
Figure 3. The network of active ingredients in Ephedra-Guizhi drug pair-intersection targets
表 1 麻黄-桂枝药对中的活性成分
Table 1 Active ingredients in Ephedra-Guizhi drug pair
MOL ID 来源 代号 化合物 OB/% DL MOL010788 麻黄 MH1 leucopelargonidin 57.97 0.24 MOL002823 麻黄 MH2 herbacetin 36.07 0.27 MOL010489 麻黄 MH3 resivit 30.84 0.27 MOL000422 麻黄 MH4 kaempferol 41.88 0.24 MOL004798 麻黄 MH5 delphinidin 40.63 0.28 MOL000098 麻黄 MH6 quercetin 46.43 0.28 MOL000006 麻黄 MH7 luteolin 36.16 0.25 MOL000449 麻黄 MH8 stigmasterol 43.83 0.76 MOL001494 麻黄 MH9 mandenol 42.00 0.19 MOL001755 麻黄 MH10 24-Ethylcholest-4-en-3-one 36.08 0.76 MOL001771 麻黄 MH11 poriferast-5-en-3beta-ol 36.91 0.75 MOL002881 麻黄 MH12 diosmetin 31.14 0.27 MOL004328 麻黄 MH13 naringenin 59.29 0.21 MOL005043 麻黄 MH14 campest-5-en-3beta-ol 37.58 0.71 MOL005190 麻黄 MH15 eriodictyol 71.79 0.24 MOL005573 麻黄 MH16 genkwanin 37.13 0.24 MOL005842 麻黄 MH17 pectolinarigenin 41.17 0.30 MOL007214 麻黄 MH18 (+)-Leucocyanidin 37.61 0.27 MOL011319 麻黄 MH19 truflex OBP 43.74 0.24 MOL001736 桂枝 GZ1 (-)-taxifolin 60.51 0.27 MOL000359 桂枝 GZ2 sitosterol 36.91 0.75 MOL000073 桂枝 GZ3 ent-Epicatechin 48.96 0.24 MOL000358 麻黄/桂枝 A1 beta-sitosterol 36.91 0.75 MOL000492 麻黄/桂枝 A2 (+)-catechin 54.83 0.24 MOL004576 麻黄/桂枝 A3 taxifolin 57.84 0.27 注：OB为口服生物利用度，DL为类药性。 
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表 2 排名前20的信号通路
Table 2 The information of top 20 pathways
编号 信号通路 靶蛋白富集数/个 P值 关键靶点 1 Hepatitis B 35 2.35E-29 TP53、JUN、AKT1、FOS、IL6、RELA、CCND1 2 Pathways in cancer 50 3.13E-29 TP53、JUN、AKT1、FOS、IL6、RELA、EGFR、CCND1 3 Bladder cancer 20 4.19E-23 TP53、EGFR、CCND1 4 Pancreatic cancer 23 5.62E-23 TP53、AKT1、RELA、EGFR、CCND1 5 TNF signaling pathway 25 2.92E-20 JUN、AKT1、FOS、IL6、RELA 6 Prostate cancer 22 2.06E-18 TP53、AKT1、RELA、EGFR、CCND1 7 Chagas disease (American trypanosomiasis) 23 4.88E-18 JUN、AKT1、FOS、IL6、RELA 8 Chronic myeloid leukemia 20 1.24E-17 TP53、AKT1、RELA、CCND1 9 Toxoplasmosis 22 2.76E-16 AKT1、RELA 10 Glioma 18 8.37E-16 TP53、AKT1、EGFR、CCND1 11 Proteoglycans in cancer 27 1.13E-15 TP53、AKT1、EGFR、CCND1 12 Non-small cell lung cancer 17 1.32E-15 TP53、AKT1、EGFR、CCND1 13 HIF-1 signaling pathway 20 4.25E-15 AKT1、IL6、RELA、EGFR 14 Colorectal cancer 17 8.17E-15 TP53、JUN、AKT1、FOS、CCND1 15 Toll-like receptor signalingpathway 20 2.93E-14 JUN、AKT1、FOS、IL6、RELA 16 Melanoma 17 8.37E-14 TP53、AKT1、EDFR、CCND1 17 Small cell lung cancer 18 1.1E-13 TP53、AKT1、RELA、CCND1 18 PI3K-Akt signaling pathway 31 3.32E-13 TP53、AKT1、IL6、RELA、EGFR、CCND1 19 Influenza A 23 4.15E-13 JUN、AKT1、IL6、RELA 20 Leishmaniasis 16 1.45E-12 JUN、FOS、RELA
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表 3 关键活性成分与5个核心靶点的对接分数
Table 3 Docking information of key active ingredients and five core targets
化合物 结构 CAS号 对接分数/(kcal·mol-1) TP53 AKT1 IL6 RELA CCND1 槲皮素 117-39-5 -8.119 -7.243 -6.321 -5.317 -5.364 木犀草素 491-70-3 -8.713 -7.537 -6.452 -5.428 -5.412 二氢槲皮素 480-18-2 -8.442 -7.738 -5.341 -5.786 -5.874 山奈酚 25615-14-9 -6.493 -7.231 -3.698 -5.228 -5.012 柚皮苷 158196-34-0 -7.430 -7.193 -3.514 -5.661 -4.312 β-谷甾醇 83-46-5 -5.700 -5.241 -3.574 -4.657 -3.162
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