A Transcriptomic Analysis of Early Adventitious Roots of Rosa chinensis Cuttings and Key Genes Screening
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摘要: 为研究月季插穗在不定根发生过程中的关键基因调控机理，利用Illumina平台测序技术对切花月季品种‘卡罗拉’插穗的3个发育阶段(不定根未启动期、愈伤组织形成期和不定根伸长期)插穗基部1 cm皮层进行转录组测序分析，结果表明：月季插穗不定根发生的3个阶段中，在不定根未启动期与愈伤组织形成期之间共筛选出差异表达基因5 033个，其中2 313个基因上调，2 720个基因下调；在愈伤组织形成期与不定根伸长期之间共筛选出差异表达基因1 865个，其中1 332个基因上调，533个基因下调；GO功能分析表明，差异表达基因主要参与生物过程、分子功能和细胞组分3大功能；KEGG富集分析结果表明，差异表达基因主要参与植物激素信号转导、次生代谢产物的合成以及碳水化合物的合成等代谢通路；将月季插穗生根过程中差异性最为显著的8个基因通过实时荧光定量PCR检测其转录水平变化，结果表明: 实时荧光定量PCR的验证结果与转录组测序结果基本一致.Abstract: In order to study the key gene regulation mechanism of Rosa chinensis cuttings in the process of adventitious root formation, the Illumina platform sequencing technology was used to analyze the three developmental stages of cutting rose cultivar 'Carola', i.e., adventitious root initiation period, callus formation period and adventitious root elongation period. A transcriptome sequencing analysis was performed on the 1 cm cortex at the base of cuttings. The results showed that at the three stages of adventitious root formation of rose cuttings, a total of 5 033 differentially expressed genes were screened between the adventitious root initiation stage and the callus formation stage, of which 2 313 genes were up-regulated and 2 720 genes were down-regulated; a total of 1 865 differentially expressed genes were screened between the callus formation period and adventitious root elongation period, of which 1 332 genes were up-regulated and 533 genes were down-regulated. The GO functional analysis showed that differentially expressed genes were mainly involved in the 3 major functions of biological process, molecule function and cell composition. The KEGG enrichment analysis showed that the differentially expressed genes were mainly involved in the metabolic pathways of plant hormone signal transduction, the synthesis of secondary metabolites and the synthesis of carbohydrates. The changes in the transcription levels of the 8 genes that exhibited the most significant differences in the rooting process were detected with real-time fluorescent quantitative PCR. The results showed that the verification results of real-time fluorescent quantitative PCR were basically consistent with the results of transcriptome sequencing.
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Keywords:
- Rosa chinensis /
- cuttings /
- adventitious roots /
- transcriptome
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月季(Rosa chinensis)作为园林绿化重要的经济作物之一，在城镇绿化中扮演着不可或缺的重要角色. 扦插繁殖是月季生产中最重要的繁殖方式，利用植物本身的营养器官(主要是茎)，在合适的外界条件下重新生成和母体性状相同的新个体. 与实生繁殖和组织培养技术相比，扦插繁殖有着繁殖速度快、成活率高、操作简单、保持母本优良性状等特点，且可以大幅降低生产成本[1]. 随着月季市场需求大幅提升，月季的繁殖速率成为市场供应的关键，而月季扦插生根率是月季产量的重要限制因素. 因此，筛选和挖掘出月季插穗生根过程中促进月季生根的关键基因，从基因水平阐明其作用机理对于提高月季扦插生根率有重要意义.
目前，转录组测序技术在阐释植物不定根形成机理方面应用广泛. 利用转录组测序技术从基因水平解释植物不定根形成的生物过程和分子机理. 对转录组结果进行微阵列分析发现：海藻糖代谢和SnRK1(蔗糖非发酵1相关蛋白激酶)参与不定根初期代谢过程[2]. 也有研究表明WOX基因参与植物不定根的初期的形成[3]，PIN1和AUX2基因有利于不定根的形成[4]. 同时利用转录组学提出可用于监测不同种康乃馨不定根发生的分子、组织学和生理学标记，为种质资源库的丰富及最佳生根品种的选择提供依据[5].
2018年6月中国月季(Rosa Chinensis)的现代品种“粉月季(Old Blush)”的全基因序列虽已揭晓[6]，但国内外对月季的研究主要集中在月季的花瓣[7]、鲜切花品质和抗病性几个方面. 但月季扦插生根过程中与不定根起始相关的基因功能却鲜有报道. 本文通过对月季扦插生根的不同时期插穗基部组织进行高通量有参转录组测序分析，筛选出能够促进月季扦插生根的关键基因. 通过GO分析和KEGG代谢通路分析，阐述参与调控插穗生根过程的代谢途径以及次生代谢产物合成的相关基因，为新疆月季规模化扦插生产提供参考依据.
1. 材料与方法
1.1 月季的扦插
通过选择处于不同生理阶段、不同条件的插穗进行扦插生根对, 比决定选取枝条健康、木质化且已经开过花的2年生月季(‘卡罗拉’)枝条(直径8~12 mm)100枝作为插穗(长度10 cm左右、留有2~3个健康芽点且保留3~5片叶)进行扦插，插穗下切口处理为45°的楔形，上端为平口. 插穗用50%多菌灵800倍液消毒后扦插在m(草炭)∶m(珍珠岩)为3∶1、深度为15 cm基质盘中，并放入植物培养室进行10 h光照/14 h黑暗培养，培养室温度保持在25 ℃左右，且低于地温1~2 ℃，每天适当通风、定期喷水消毒至插穗成功移栽.
1.2 转录组材料的选取
按照1.1的培养方法进行转录组材料选取的预实验后(图 1)，分别选取扦插第1天(不定根未启动期)、第8天(愈伤组织期)、第21天(不定根伸长期)插穗基部上1 cm左右的皮层组织为材料，每个时期的样品2个重复，取材后立即放入液氮冷冻，后储存于-80 ℃冰箱，用于RNA的提取.
1.3 总RNA的提取
将月季扦插生根过程中的3个不同时期插穗用美国OMEGA公司的植物提取试剂盒提取总RNA，通过浓度、纯度及电泳检测后由南京派森诺基因科技公司使用Agilent 2100 Bioanalyzer检测提取的Total RNA的完整性，检测合格后用于文库构建及后续转录组测序.
1.4 Illumina测序文库的构建及测序数据分析
1.4.1 Illumina测序文库的构建
6个待测样品(每个样本2个重复)利用mRNA特有的polyA结构，通过Oligo(dT)磁珠富集总RNA中带polyA结构的mRNA来纯化总RNA中的mRNA. 然后利用离子打断的方式将mRNA打断成300 bp左右的片段，采用双端测序模式以RNA为模板，用6碱基随机引物和逆转录酶合成cDNA. 文库构建完成后，根据片段的大小及各样本上Index序列的不同区分不同的文库，待测样本的文库名见表 1. 最后通过Agilent 2100 Bioanalyzer对文库进行质检，保证文库构建质量[8].
表 1 文库基本情况Table 1. The basic information of the library样品 样品名称 文库名 不定根未启动期 A1 LRA13418 A2 LRA13419 愈伤组织期 B1 LRA13420 B2 LRA13421 不定根伸长期 C1 LRA13422 C2 LRA13423 注：A1、A2为不定根未启动期的2个平行样本；B1、B2为愈伤组织期的2个平行样本；C1、C2为不定根伸长期的2个平行样本. 1.4.2 转录组测序数据分析
样品上机测序后经软件转化生成原始数据(下机数据)，这些数据包含一些接头、低质量的Reads, 采用Cutadapt去除带接头的序列以及平均质量分数低于Q20的Reads. 然后，用Reads平均质量分布图检测数据的平均质量分布. 用HISAT2将过滤后的Reads比对到参考基因上，看测序序列的Mapping比例是否高于70%. 最后，将比对到基因组上的Reads分布情况进行统计，定位区域分别为CDS(编码区)、Intron(内含子)、Intergenic(基因间区)和UTR(5′和3′非翻译区).
1.5 表达量分析
使用HTSeq软件统计比对有参转录组测序的基因原始表达量到每一个基因上的Read Count值[9]. 采用FPKM值(每百万Reads中来自某一基因的每千碱基长度的Reads数目)对基因表达量进行标准化(Normalization)[10]，在有参转录组中，一般认为FPKM>1, 则基因表达.
1.6 差异表达基因筛选及功能富集分析
采用DESeq对基因表达进行差异分析，筛选差异表达基因条件为：表达差异倍数|log2FoldChange|>1，显著性P < 0.05. 按照筛选条件进行差异表达基因筛选[9]. 对差异基因进行GO功能注释和KEGG代谢通路分析.
1.7 基因表达检测
所有样本按照1.3方法提取RNA后，采用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(cDNA一链合成试剂盒)对所提取的RNA进行逆转录合成cDNA. 选择3个阶段样本表达差异最为显著的8个基因(按照1.6的筛选条件)，用Primer Premier 6软件设计Real Time PCR引物(表 2)，进行实时荧光定量PCR分析. 以反转录产物cDNA为模板，以GAPDH为内参，引物合成以后使用SYBR GreenⅠ法进行Real Time PCR. PCR的扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s, 40个循环. 扩增结果按照2-ΔΔt相对定量法分析基因的相对表达量.
表 2 检测基因表达的引物序列Table 2. The primer sequence of gene expression detected基因编号 正向序列(5'-3') 反向序列(5'-3') PCR产物/bp GAPDH GGAAAGGTTCTGCCTGCTC CTGGTCATAGGTTGCCTTCTTC 139 LOC112189488 CTCTACCCTGCTGCCCCACT GCGACTCATCACCACCGTTT 187 LOC112186298 GGAGCATTTGTCCAGTTCGT GCCATTAGTAGCCGCCTTT 180 LOC112165178 GCATGGGAGTTGTGGAAAGA AGGTGCAGGTAATCGTGAGC 198 LOC112172220 CCACCCTCTTGAGCCTTACC AGCATTTCCTCCATCTCCTTC 165 LOC112179697 TCTATCCTCGCCAGCCACT ACCGTCCTCGAATACTCCTTC 187 LOC112164736 TCCTAAGCAATGGTCTAAAGCC TCCGCATAGTCCCGAAAA 124 LOC112193119 TGAAAACCCGATTCCCATC GGTCAAGAACCCACCCAATG 115 LOC112194361 TGTTGTCATTCCTGCGTTTG TGGTGCTGCTGAGGTTGC 127 2. 结果与分析
2.1 月季生根过程中测序质量分析
样品经过Illumina平台上机测序后，生成FASTQ的原始数据. 对每个样品的下机数据进行统计整理，通过Q20和Q30所占百分比说明碱基识别的准确率，即测序质量. 由表 3可知，Q20的百分比都在95%以上，Q30的百分比都在90%以上，说明月季生根过程的转录组测序质量较好，可以做进一步的分析研究.
表 3 下机数据统计Table 3. The statistics of offline data样品 Reads/条 碱基总数/bp Q30/bp N/% Q20占碱基数的百分数/% Q30占碱基数的百分数/% Clean Reads占Reads的百分数/% A1 41 432 804 6 214 920 600 5 608 791 753 0.003 266 95.89 90.24 92.26 A2 44 353 390 6 653 008 500 6 057 901 035 0.003 008 96.30 91.05 92.80 B1 39 577 678 5 936 651 700 5 384 791 893 0.003 314 96.09 90.70 92.83 B2 43 275 996 6 491 399 400 5 900 420 774 0.003 278 96.19 90.89 92.73 C1 45 240 742 6 786 111 300 6 172 944 331 0.003 262 96.26 90.96 92.52 C2 48 695 120 7 304 268 000 6 625 080 997 0.003 226 96.11 90.70 92.91 注：Q20(bp)：碱基识别准确率在99%以上的碱基总数；Q30 (bp)：碱基识别准确率在99.9%以上的碱基总数；N(%)：模糊碱基所占百分比；Clean Reads占Reads的百分数(%)：高质量序列碱基占测序碱基的百分比. 2.2 数据库的注释情况
基因序列在不同数据库的注释情况各有不同，NCBI数据库、UniProt蛋白数据库、GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库中都有注释. 其中，NCBI数据库的注释率为100%，UniProt蛋白数据库的注释率为83.30%，GO和KEGG数据库的注释率分别为63.68%和28.97%(表 4).
表 4 参考基因组信息Table 4. The information of reference genome数据库 基因注释数 基因注释率/% NCBI_GeneID 30 216 100 UniProt 25 170 83.30 GO 19 242 63.68 KEGG 8 754 28.97 2.3 生根过程中差异表达基因分析
根据月季扦插生根的3个不同时期(不定根未启动期(A)、愈伤组织期(B)和不定根伸长期(C))的差异表达基因量，筛选出不同时期的差异表达基因. 以不定根未启动期为对照组的愈伤组织期共统计到5 033个差异表达基因，其中上调基因2 313个，下调基因2 720个(图 2A). 以愈伤组织期为对照组的不定根伸长期共统计到1 865个差异表达基因，其中有1 332个基因上调，533个基因下调(图 2B).
2.4 差异表达基因GO功能分析
对统计到的差异表达基因进行GO功能分析，主要分为生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组成(CC)3大类. 从不定根未启动期到愈伤组织期(图 3)，参与生物过程(BP)的差异表达基因共注释到1 328个条目，占比为48.7%，注释到4条(84个差异基因)关于生长素(Auxin)信号的条目；注释最多的基因条目包括代谢过程、有机物代谢过程、初级代谢过程、氮化合物代谢过程和生物合成过程. 这说明生长素类在愈伤组织形成阶段起到重要作用，能够促进愈伤组织的形成. 参与分子功能的差异表达基因共注释到1 133个条目，占比为41.6%，其中差异性最显著的条目为ADP结合、氧化还原酶活性，差异基因数分别为185和474，注释最多的基因条目包括催化活性、有机化合物结合、水解酶、转移酶活性等. 这表明氧化还原酶类可能与调控愈伤组织的形成有关. 参与细胞组成的差异表达基因共注释到260个条目，占比为9.5%，其中差异性最显著的条目为细胞外区域，该条目富集到110个差异基因，其中47个基因上调，注释最多的基因条目包括膜的固有成分、膜的组成成分、细胞和细胞器.
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图 3 不定根未启动期与愈伤组织阶段GO富集分析柱状图注：横坐标为Go level2等级的term，纵坐标为每个term富集的-log10(p值).Figure 3. The histogram of the GO enrichment analysis at the cutting and callus stages愈伤组织期到不定根伸长期的GO功能分析结果与图 3相似(结果未显示)，参与生物过程的差异表达基因共注释到865个条目，占GO分析的49.4%, 其中差异性最显著的条目为脱落酸激活的信号通路，该条目富集到25个差异基因，有6个条目共15个差异基因注释到关于生长素的代谢，比愈伤组织期表达量降低，说明低浓度的生长素能够有效地促进不定根的生长. 注释最多的基因条目包括：细胞过程、代谢过程、初级代谢过程和生物合成等. 参与分子功能的差异表达基因共注释到754个条目，占GO分析的43.1%，注释最多的基因条目包括催化活性、离子结合、转移酶活性和水解酶活性. 参与细胞组成的差异表达基因共注释到130个条目，占GO分析的7.4%，差异性最显著的条目为膜的固有成分，该条目共有495个基因，其中上调基因有394个. 注释最多的基因条目包括：膜的固有成分、膜的组成部分和细胞器. 因此，在月季扦插生根的不同生长发育阶段，参与愈伤组织形成和不定根生长发育过程中，发挥催化活性、核苷酸结合和氧化还原酶代谢等分子功能；提供能量的碳水化合物代谢、调节生长发育的生长激素信号传导等生物过程共同调控各阶段细胞成分变化和不定根的生长发育.
2.5 差异表达基因KEGG富集分析
通过KEGG富集分析月季扦插生根过程中参与的代谢途径发现：参与的生物过程主要包括代谢过程(Metabolism)、遗传信息反应(Genetic Information Processing)、环境信息响应(Environmental Information Processing)、细胞过程(Cellular Processes)和生物系统(Organismal Systems)5个水平，共有4 133个基因在这些途径中进行了功能注释. 不定根未启动期与愈伤组织期阶段富集的代谢通路共114条；其中有86条通路参与新陈代谢过程，主要包括苯丙素生物合成、谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、类黄酮代谢油菜甾体生物合成、酪氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢以及氮代谢；有18条通路参与遗传信息反应，主要包括DNA复制、RNA聚合、降解和转运、不匹配修复、核苷酸修复、同源重组以及泛素介导的蛋白质水解；有4条通路参与环境信息响应，主要包括植物激素信号转导、MARK信号通路、磷脂酰肌醇信号系统；有2条通路参与生物系统水平，主要包括植物-病原菌相互作用、植物的昼夜节律；有3条通路参与细胞过程，主要包括细胞内吞作用、吞噬体过程和过氧化物酶体过程.
将不定根未启动期到愈伤组织期阶段KEGG富集结果，通过Rich Factor(指该Pathway中富集到的差异基因个数与注释到的基因个数的比值)、FDR值来衡量富集的程度. Rich Factor越大，表示富集的程度越大. FDR一般取值范围为0~1，越接近于零，表示富集越显著. 挑选FDR值最小(即富集最显著)的前20条KEGG Pathway进行展示(图 4). 结果显示：主要参与苯丙素生物合成、谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、类黄酮生物合成、植物激素信号转导和淀粉、蔗糖代谢等通路.
愈伤组织期与不定根生长阶段共富集到100条代谢通路，有76条通路参与代谢过程，主要包括淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷生物合成、萜类骨架的生物合成、ɑ-亚油酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成和氮素代谢，其中有14条通路参与遗传信息响应，主要包括DNA复制和修复、RNA聚合、降解和转运以及泛素介导的蛋白质水解；有4条通路参与环境信息响应，包括植物MAPK信号通路、ABC运输、植物激素信号转导、磷脂酰肌醇信号系统；有2条通路参与生物系统水平，包括植物-病原菌相互作用、植物昼夜节律；有3条通路参与细胞过程，包括吞噬体、过氧化物酶体和内吞作用.
用Venn图对扦插生根过程中3个不同时期都有表达的差异基因进行统计(图 5)，由图可知：共有536个差异基因在3个不同发育阶段都表达，306个基因表达上调，占总差异基因的57.1%，主要在淀粉和蔗糖代谢、硫胺素代谢、植物激素信号转导、类黄酮生物合成、DNA复制和修复等代谢通路上. 下调基因有181个且主要集中在苯丙素代谢、谷胱甘肽代谢、淀粉和蔗糖代谢、α-亚麻酸代谢、植物-病原菌间的相互作用和磷酸戊糖途径等代谢通路上. 说明扦插生根过程中，首先要保证机体的正常生命活动的能量代谢、氨基酸代谢、物质运输外，还需要遗传信息的表达调控、对外界环境刺激的反应和激素的信号转导协同作用下促使插穗生根.
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图 5 扦插生根不同时期的差异表达基因维恩图注：A-B: 不定根未启动期与愈伤组织期；A-C: 不定根未启动期与不定根伸长期；B-C: 愈伤组织期与不定根伸长期.Figure 5. The Venn diagram of differentially expressed genes at different stages of rooting2.6 月季不定根发育过程中差异基因表达量变化
根据GO功能注释和KEGG代谢通路分析筛选出8个上调基因，编号分别是LOC112189488、LOC112186298、LOC112165178、LOC112172220、LOC112179697、LOC112164736、LOC112193119和LOC112194361，利用qRT-PCR进行验证(图 6)，发现在不定根未启动期与愈伤组织期的4个编号为LOC112189488、LOC112186298、LOC112165178、LOC112172220的基因与愈伤组织期和不定根伸长期的4个编号为LOC112179697、LOC112164736、LOC112193119、LOC112194361的基因均为上调表达基因，测序中获得的表达趋势与qRT-PCR分析的基因表达趋势基本一致.
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图 6 qRT-PCR检测月季扦插生根过程中2个阶段差异基因的表达Figure 6. The differential gene expression at 2 rooting stages detected with qRT-PCR将8个差异基因的全基因序列在NCBI、GO和KEGG数据库中进行序列比对，找出该基因的功能注释情况. 结果可知：编号LOC112189488为细胞色素P450 81E基因家族，是一种单加氧酶类，通过GO分析发现主要有氧化还原酶活性、血红素结合、铁离子结合、单加氧酶活性以及离子结合功能；编号LOC112186298属于MLO1蛋白质基因家族，是植物特有的一种抗病基因，GO分析发现该基因主要表达为膜的组成部分及对刺激的反应；编号LOC112165178属于Ser/Thr蛋白激酶家族中的GsSRK At67520激酶，具有蛋白Ser/Thr激酶活性，主要参与碳水化合物的合成、免疫应答及蛋白质磷酸化作用，调控插穗生根过程中的能量合成以及蛋白质的代谢，GO分析发现该基因能够在离子结合、核糖核苷酸结合以及小分子结合过程中发挥作用；编号LOC112172220属于肉桂醇脱氢酶1(CAD1)基因家族，参与苯丙烷类木质素生物合成，是催化木质素生物合成途径中的关键步骤，GO分析表明该基因具有氧化还原酶活性、离子结合、催化活性及肉桂醇脱氢酶活性，KEGG中该基因主要富集在苯丙烷生物合成代谢通路(ko: 00940).
编号LOC112179697为PME41基因家族，控制果胶酯酶/果胶酯酶抑制剂(PME/PMEI)的表达，有研究表明PME基因的表达水平能够影响植物的生理过程(如：根的伸长、根部发育)，GO分析发现该基因有酶抑制剂活性、催化活性、酶调节活性并参与碳水化合物代谢过程，KEGG代谢为戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化通路(ko: 00040)；编号LOC112164736为β-葡萄糖苷酶12(BGLU12)基因，属于糖苷水解酶家族GH1，水解末端非还原性β-D-葡萄糖基残基，并释放β-D-葡萄糖，GO分析发现该基因具有催化活性、水解酶活性，作用于O-糖基化合物的糖基键并参与碳水化合物代谢过程，KEGG富集分析发现其在淀粉和蔗糖代谢(ko: 00500)、苯丙烷生物合成(ko: 00940)和氰氨基酸代谢(ko: 00460)通路上有所富集；编号LOC112193119为UGT85A24基因，编码7-葡萄糖基转移酶，属于糖基转移酶家族1(GT1)，GT1是植物界最大的糖基转移酶家族，GO分析发现该基因具有催化活性、转移酶活性，转移己糖基和7-脱氧葡萄糖酸葡萄糖基转移酶活性；编号LOC112194361为PLP2基因，编码水解酶类，GO分析发现主要有催化活性、水解酶活性，参与脂类代谢、分解代谢、有机物分解过程等.
3. 讨论
以月季品种‘卡罗拉’插穗为实验材料，对月季扦插生根过程中3个不同生长阶段的插穗进行转录组测序，旨在筛选出能够启动不定根发生的关键基因，以期得到具有较高生根率的转基因月季. 转录组测序结果中每个样品的Clean Data达到92%以上，Q30均达到90%以上，说明此次转录组数据质量较好. 不定根未启动期与愈伤组织期共筛选出5 331个差异表达基因，其中2 313个基因上调，2 720个基因下调，共有61个条目(1 197个基因)参与氧化还原酶类代谢，这说明在愈伤组合形成过程中氧化还原酶类发挥了重要调控作用. 愈伤组织期与不定根伸长期共筛选出1 865个差异基因，1 332个基因上调，533个基因下调. 其中，富集到865个条目参与了生物代谢过程. 本次研究过程中，富集的差异表达基因通过GO功能分析和KEGG通路富集分析发现：GO功能分析主要包括细胞组成、结合过程、催化活性和代谢过程等生物过程. KEGG富集分析主要参与信号转导、能量代谢、氨基酸代谢、膜运输、碳水化合物代谢等通路.
扦插生根过程中不定根未启动期与愈伤组织期的4个基因中. 编号为LOC112189488的基因编码细胞色素P450(CYP450)的合成，细胞色素P450数目占整个基因组基因数目的1%左右，CYP450基因能够合成生长素的前提物质(IAOx)[11]，在拟南芥中发现参与Trp合成生长素IAA[12]. 生长素是促进不定根起始的关键因素，测序结果显示该基因表达上调，推测该基因可能促进插穗体内生长素的合成，促进不定根的起始. 编号为LOC112186298的基因属于MLO1蛋白质基因家族，是植物所特有的一类重要抗白粉病基因. 对白粉病有广谱抗性且能够特异地调控细胞死亡，利用自发的细胞死亡来应答发育或非生物刺激[13]. 有研究表明，MLO1蛋白质不仅对白粉病有抗性，同时对植物的生长发育也具多重效应[14]. 白粉病和黑斑病是月季最常见的病害，潮湿环境中产生此病害的几率较高，推测该基因在插穗生根过程中为维持机体正常生长发育，MLO1基因的上调表达增强了插穗生根过程中的抗病性. 编号为LOC112165178的基因属于蛋白激酶超家族，Ser/Thr蛋白激酶家族中的GsSRKAt67520激酶，同时又属于MYB转录因子家族，植物转录因子MYB具有促进植物根部生长发育的作用[15]，该基因表达量上调，推测该基因可能在插穗生根过程中，具有促进不定根生长的作用. 编号为LOC112172220的基因属于肉桂醇脱氢酶基因(CAD1)家族，参与苯丙烷类木质素生物合成，并在逆性环境中发挥重要作用. 木质素是植物苯丙烷代谢途径中的重要产物之一，是植物生长所需的机械支撑物，有助于促进植物发育过程中木质部导管的形成，水分和养分的运输，受生长素ARF-Aux/IAA信号途径的调控[16]，同时CAD1基因及基因家族在植物生长发育很多过程都有重要作用. 该基因表达量上调，推测该基因可能与月季插穗在生根过程中的生根发育过程有关.
愈伤组织期与不定根伸长期的4个差异基因中，编号LOC112179697为PME41基因家族，控制果胶酯酶/果胶酯酶抑制剂(PME/PMEI)的表达，有研究表明果胶甲基酯酶对细胞壁强度及细胞生长具有调节作用. 通过与BR的det2作用调控根的生长，推测该基因表达量增加能够促进月季不定根伸长，这与张清凤等[17]的研究结果相一致. 编号LOC112164736为BGLU12基因，属于糖苷水解酶GH1家族，释放β-D-葡萄糖. β-葡萄糖苷酶属于糖基水解酶家族Ⅰ成员[18]. 而不定根发生过程中消耗大量的营养物质(主要为碳水化合物)供插穗基部愈伤组织和根源基的能量需要. 推测该基因的表达提高可能参与了不定根生长发育过程中的新陈代谢. 编号LOC112193119为UGT85A24基因，属于糖基转移酶家族1(GT1)，GT1基因家族以活化的尿苷二磷酸糖类为供体，又被称为UGTs[19]. 该基因表达量上调，推测该基因可能参与不定根生长发育过程中糖类代谢. 编号LOC112194361为PLP2基因，表达为水解酶类，在根部特异性表达，具有磷酸酶和脂肪酶活性，参与脂质代谢过程，氧脂生物合成过程. 在细胞死亡过程中起着至关重要的作用，并差异性影响脂蛋白的生物合成及对病原体的抵抗力，该基因表达量上调，可能与插穗生根过程中的物质代谢有关.
扦插生根是由物种的遗传信息和外界环境共同决定的结果. 其中植物激素在不定根生长发育中起关键作用. 1934年荷兰生理学家温特(Went F W)最早发现植物激素对于植物生根有促进作用，后经证实生长素对插穗的生根起显著作用[20]. 插穗不定根形成过程中有多种代谢途径共同调控，随着不定根的发生，酶和激素等代谢途径都发生变化. 生长素在根系发育中的单一性作用与其他植物激素，如细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、乙烯、油菜素类固醇、茉莉酸、多胺和独角金内脂等发生协同或拮抗作用，触发级联反应，导致不定根的形成和发育[21]. 根的生长发育是内源生长素(GO: 0009926，GO: 0009733等)和细胞分裂素(GO: 0009690，GO: 0000910等)相互作用的结果，两者通过调控Aux/IAA基因家族的SHY2(SHORT HYOPCOTYL2)基因表达来实现这一生物过程[22]. 其中，内源脱落酸(GO: 0009738，GO: 0009737等)是一种抑制激素，低浓度的脱落酸能够促进不定根的发生[23]. 油菜素类固醇(BRs)(GO: 0009741，GO: 0009742、GO: 0071367)作为一种植物生长激素，能够促进细胞的增殖和顶端优势, 同时控制根的纵向和横向生长[24].
GO功能分析和KEGG富集分析也充分证明了月季扦插生根过程中生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸等6种植物内源激素都参与了生根的过程. 转录组测序结果显示脱落酸代谢途径富集显著. 这可能与脱落酸抑制生长素的表达有关. 但插穗生根的起始与发育是一个复杂的代谢调控体系，扦插生根过程中差异性表达最为显著的8个基因功能，将通过进一步的转基因拟南芥进行验证，为进一步筛选启动月季扦插生根的关键基因提供一定的理论依据.
致谢: 感谢华南师范大学生命科学学院李玲教授对本论文的指导. -
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图 3 不定根未启动期与愈伤组织阶段GO富集分析柱状图
注：横坐标为Go level2等级的term，纵坐标为每个term富集的-log10(p值).
Figure 3. The histogram of the GO enrichment analysis at the cutting and callus stages
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图 5 扦插生根不同时期的差异表达基因维恩图
注：A-B: 不定根未启动期与愈伤组织期；A-C: 不定根未启动期与不定根伸长期；B-C: 愈伤组织期与不定根伸长期.
Figure 5. The Venn diagram of differentially expressed genes at different stages of rooting
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图 6 qRT-PCR检测月季扦插生根过程中2个阶段差异基因的表达
Figure 6. The differential gene expression at 2 rooting stages detected with qRT-PCR
表 1 文库基本情况
Table 1 The basic information of the library
样品 样品名称 文库名 不定根未启动期 A1 LRA13418 A2 LRA13419 愈伤组织期 B1 LRA13420 B2 LRA13421 不定根伸长期 C1 LRA13422 C2 LRA13423 注：A1、A2为不定根未启动期的2个平行样本；B1、B2为愈伤组织期的2个平行样本；C1、C2为不定根伸长期的2个平行样本. 
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表 2 检测基因表达的引物序列
Table 2 The primer sequence of gene expression detected
基因编号 正向序列(5'-3') 反向序列(5'-3') PCR产物/bp GAPDH GGAAAGGTTCTGCCTGCTC CTGGTCATAGGTTGCCTTCTTC 139 LOC112189488 CTCTACCCTGCTGCCCCACT GCGACTCATCACCACCGTTT 187 LOC112186298 GGAGCATTTGTCCAGTTCGT GCCATTAGTAGCCGCCTTT 180 LOC112165178 GCATGGGAGTTGTGGAAAGA AGGTGCAGGTAATCGTGAGC 198 LOC112172220 CCACCCTCTTGAGCCTTACC AGCATTTCCTCCATCTCCTTC 165 LOC112179697 TCTATCCTCGCCAGCCACT ACCGTCCTCGAATACTCCTTC 187 LOC112164736 TCCTAAGCAATGGTCTAAAGCC TCCGCATAGTCCCGAAAA 124 LOC112193119 TGAAAACCCGATTCCCATC GGTCAAGAACCCACCCAATG 115 LOC112194361 TGTTGTCATTCCTGCGTTTG TGGTGCTGCTGAGGTTGC 127
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表 3 下机数据统计
Table 3 The statistics of offline data
样品 Reads/条 碱基总数/bp Q30/bp N/% Q20占碱基数的百分数/% Q30占碱基数的百分数/% Clean Reads占Reads的百分数/% A1 41 432 804 6 214 920 600 5 608 791 753 0.003 266 95.89 90.24 92.26 A2 44 353 390 6 653 008 500 6 057 901 035 0.003 008 96.30 91.05 92.80 B1 39 577 678 5 936 651 700 5 384 791 893 0.003 314 96.09 90.70 92.83 B2 43 275 996 6 491 399 400 5 900 420 774 0.003 278 96.19 90.89 92.73 C1 45 240 742 6 786 111 300 6 172 944 331 0.003 262 96.26 90.96 92.52 C2 48 695 120 7 304 268 000 6 625 080 997 0.003 226 96.11 90.70 92.91 注：Q20(bp)：碱基识别准确率在99%以上的碱基总数；Q30 (bp)：碱基识别准确率在99.9%以上的碱基总数；N(%)：模糊碱基所占百分比；Clean Reads占Reads的百分数(%)：高质量序列碱基占测序碱基的百分比.
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表 4 参考基因组信息
Table 4 The information of reference genome
数据库 基因注释数 基因注释率/% NCBI_GeneID 30 216 100 UniProt 25 170 83.30 GO 19 242 63.68 KEGG 8 754 28.97
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