A Molecular Docking-based Analysis of the Impact of Ursolic Acid Derivative H21 on Inflammation-Causing Key Proteins
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摘要: 利用分子对接方法，探究 H21 对分泌炎症因子的关键蛋白的影响. 从引起炎症的经典通路中选取关键靶蛋白，通过Glide分子对接，将 H21 和原配体、靶蛋白对接. 通过二者对接得到分值，筛选与 H21 结合较好的靶蛋白及关键氨基酸，并分析其二者的相互作用. 结果显示： H21 与Toll-like通路中关键蛋白IRAK1蛋白结合较好，Glide-gscore为-9.873, 优于原配体， H21 与IRAK1结合的关键氨基酸为Ile218；理论数据表明：抗炎药物 H21 可能作用于IRAK1蛋白，通过影响IRAK1蛋白的表达，从而发挥抗炎作用，为揭示 H21 的抗炎机制和作用靶点提供了理论依据.Abstract: The molecular docking method was used to explore the impact of H21 on key proteins secreting inflammatory factors. Key target proteins were selected from the classic pathways that cause inflammation and H21 and the original ligand with the target protein were docked through Glide molecular docking. The target proteins and key amino acids that were well bound to H21 were screened, and the interaction between them was analyzed. The results showed that H21 bound well to the key protein IRAK1 protein in the Toll-like pathway, and the Glide-gscore is -9.873, better than that of the original ligand. The key amino acids for H21 binding to IRAK1 is Ile218. Theoretical data indicated that the anti-inflammatory drug H21 may act on IRAK1 protein, and by affecting the expression of IRAK1 protein, will exert anti-inflammatory effect. That may provide a theoretical basis for the anti-inflammatory mechanism of H21 and its target of action.
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据统计，近年来非甾体抗炎药用量仅次于抗菌药物，消耗量巨大，但其长期大剂量服用可导致胃肠道、肝脏、血液系统以及心脏甚至是皮肤的损害等[1-4]，如阿司匹林、布洛芬. 目前，开发抗炎效果良好、毒副作用少的药物研究较多，但对其抗炎作用机制研究较少[5-6].
熊果酸(UA)是一种存在于多种植物中的五环三萜类化合物. 未志俞等[7]以熊果酸为原料，通过对C28位进行结构修饰合成了熊果酸衍生物H21，其抗炎效果优于同剂量的布洛芬和吲哚美辛，但H21的抗炎作用机制尚不明确[8].
基于分子对接的虚拟筛选技术作为辅助药物设计的一项重要方法，在揭示药物与机体靶点的作用机制以及在新药研发的过程中发挥着极大的作用[9]. 以融合基因Bcr-Abl为靶点，通过分子对接等技术筛选出候选化合物STI571，它在体外能够选择性抑制Bcr-Abl蛋白活性，并能在体内外抑制Bcr-Abl表达细胞的增殖，而不作用于正常细胞, 这就是首个上市的分子靶向药物——格列卫，其开创了肿瘤分子靶向治疗的新时代[10]. 暨南大学药学院在新选择性DDR1单抑制剂的基础上，通过分子对接等技术筛选DDR1和DDR2高选择性双重抑制剂，最终得到化合物5N[11]. 实验表明，5N在体内外均有良好的抗炎作用，这也是首次在体内研究高选择性DDR1和DDR2双重抑制剂作为新型抗炎药[11]. 目前，基于分子对接方法的虚拟筛选已经成为针对特定靶蛋白药物研发的必备流程之一[12].
分子对接等计算机辅助药物设计方法相比于其他传统的筛选方法，能够有效提高筛选效率[13]. 为了探讨熊果酸衍生物H21的抗炎作用机制，本论文利用了计算机辅助药物分子设计寻找药物活性靶技术[2]. 该技术通过分子模拟筛选和分子对接，从构建的蛋白数据库中筛选出与药物分子结合较好的靶标蛋白，分析二者之间的相互作用，这样能够准确研究药物作用机理，进而减少研究药物作用机理的实验成本和时间[14-16].
因此，本研究利用该技术的优点和灵活性，通过反向对接的方法，运用分子对接筛选四大经典炎症通路中与H21结合较好的靶蛋白，分析H21与炎症因子的相互作用形式，进而探究H21发挥抗炎作用的作用机制和作用靶点，为揭示H21的抗炎机制和作用靶点提供理论依据.
1. 研究方法
1.1 靶标蛋白的确定
JAK-STAT、NF-κB、MAPK、Toll-like通路是经典的炎症通路. 从4条通路(JAK-STAT、NF-κB、MAPK、Toll-Like)中选取关键靶蛋白，从UniProt(https://www.uniprot.org/)网站中筛选上述靶蛋白，筛选依据是：(1)选择来源：人源; (2)配体：选择只含一个配体的，选择含有配体的原因是因为以原配体和蛋白的对接分数为基准，若药物分子和靶蛋白对接分数优于原配体和靶蛋白的对接分数，说明药物分子对接效果优于原配体对接效果，即对接结果较好，反之亦然; (3)基因：无突变基因的靶蛋白; (4)分辨率：尽可能选择分辨率高的蛋白. 靶标蛋白的三维晶体结构在RCSB PDB(https://www.rcsb.org/)网站下载.
1.2 H21和原配体的优化
利用软件ChemDraw Ultra8.0以及Chem 3D 17.1构建抗炎药物H21的3D结构，然后导入Maestro 11.2中，利用“Ligprep”工具以“OPLS_2005”力场进行结构优化及3D结构转化，将H21和靶标蛋白原配体结果保存为“·mae”文件格式用于后续分子对接[17].
1.3 靶标蛋白优化及活性位点的预测
利用Maestro 11.2“Protein Preparation Wizard ”工具对靶标蛋白进行加氢、去水等结构优化，以“Sitemap”程序预测靶标蛋白潜在的活性位点. 以“Receptor Grid Generation”程序确定预测的活性位点.
1.4 分子对接
通过“Ligand Docking”工具，将最小化的靶蛋白和其优化后的原配体进行分子对接，并且将H21与靶蛋白的不同活性位点分别进行对接.
以“Glide-gscore”和“Glide-energy”得分函数值评价小分子与靶蛋白的相互作用，该函数综合考虑了氢键、疏水、范德华力等相互作用，其绝对值越大，表明小分子与靶蛋白的对接复合物越稳定、匹配结合作用越好. 通过抗炎药物H21和靶蛋白对接以及原配体和靶蛋白对接分数的比较，并分析二者的相互作用.
2. 结果与讨论
分子对接是依据“诱导契合学说”原理，从已知结构的受体和配体出发，通过化学计量方法模拟、识别并预测受体-配体复合物结构的方法[18]. H21结构如图 1.
2.1 Glide-gscore分析
从4条通路(JAK-STAT、NF-κB、MAPK、Toll-like)中选取关键靶蛋白，共29个靶蛋白，共预测有133个活性位点，其中有6个靶蛋白的活性位点并未对接成功，选取29个靶蛋白的多个活性位点中Glide-gscore绝对值最大的记录打分值汇总结果见表 1. 其中，NF-κB和Toll-like通路对接效果总体优于JAK-STAT和MAPK通路，Toll-like通路中IRAK1蛋白对接效果优于IRAK4，IRAK1 Glide-gscore为-9.873，在29个靶蛋白中对接效果突出.
表 1 靶蛋白与H21对接汇总Table 1. The docking summary of target protein and H21蛋白 对接分数 对接能量 蛋白 对接分数 对接能量 RIP -3.364 -43.325 P38γ -5.002 -52.878 IκB -4.495 -44.574 MEK1 -4.297 -43.251 TAK1 -5.810 -52.784 PKCα -6.184 -50.677 RIP2 -6.172 -47.417 RASN -3.043 -41.289 IRAK1 -9.873 -61.601 ERK2 -4.388 -41.848 IRAK4 -4.261 -44.487 ERK1 -3.216 -38.583 MK2 -5.521 -47.589 RASK -3.096 -33.033 MK3 -4.785 -45.819 KSR2 -3.716 -39.419 TYK2 -3.890 -37.062 PKCβ -3.885 -47.956 JAK2 -4.230 -52.320 CRAF -2.570 -42.002 MSK1 -5.347 -42.120 JNK3 -6.019 -49.533 P38β -3.656 -50.414 JNK1 -4.579 -47.221 MKK6 -2.712 -45.235 MKK4 -4.398 -40.509 P38α -5.341 -31.335 ASK1 -4.283 -50.710 P38ξ -3.944 -44.443 2.2 H21与IRAK1相互作用分析
分析IRAK1与抗炎药物H21的相互作用如图 2，IRAK1蛋白与H21形成分子口袋如图 3. Glu215侧链上的羧基与熊果酸衍生物H21的羟基形成氢键相互作用，Leu291与Phe290形成的肽键与H21杂环上的氧形成氢键相互作用. 抗炎药物H21与氨基酸Ile218、Val226、Ala237、Val272、Tyr288、Phe290、Leu291、Pro292、Leu347、Cys302、Ala306、Cys307形成疏水相互作用.
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图 2 IRAK1受体与H21的相互作用Figure 2. The interaction of IRAK1 receptor and H212.3 原配体与IRAK1相互作用分析
分析IRAK1与原配体的相互作用如图 4，IRAK1蛋白与原配体形成分子口袋如图 5. 原配体与氨基酸Asp298、Ile218、Glu220形成氢键相互作用，同时与Asp298形成盐桥相互作用.
抗炎药物H21与原配体均能与IRAK1氨基酸Ile218等形成关键相互作用，且H21 Glide-gscore为-9.873，原配体Glide-gscore为-4.773，H21 Glide-gscore优于原配体，理论结果表明H21与IRAK1的结合优于原配体.
白细胞介素-1受体相关激酶(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)是一种丝氨酸苏氨酸激酶[19-20]，位于细胞质和细胞核中，是Toll-like受体和白细胞介素-1受体信号传递过程的关键节点，具有介导Toll-like受体和IL-1信号通路的作用[21]. Toll-like通路介导的信号通路控制多种细胞的生理代谢过程，如炎症，凋亡和细胞分化等[22].
3. 结论
熊果酸衍生物H21具有良好的抗炎效果及较低的细胞毒性，但其抗炎机制尚不明确. 通过分子对接探究经典炎症通路中分泌炎症因子的关键蛋白，初步筛选了熊果酸衍生物H21发挥抗炎作用的靶蛋白. 先天性免疫信号传导在炎症中起着至关重要的作用，白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK)家族成员是先天免疫中Toll-like受体和IL-1受体信号转导的关键介质，因此可作为疾病的潜在治疗靶标[23]. 其中，IRAK1作为Toll-like受体和信号传递过程的关键节点，在介导Toll-like受体和信号通路中发挥关键作用. 抗炎药物H21与Toll-like通路中IRAK1蛋白结合较好，H21与IRAK1结合的关键氨基酸为Ile218. 理论数据表明抗炎药物H21其可能影响IRAK1蛋白的表达，进而发挥抗炎作用，后续研究可以通过细胞实验及结合实验验证抗炎药物H21对IRAK1蛋白的作用.
本研究利用计算机辅助药物设计通过分子对接的方法预测了抗炎药物H21的作用靶点和作用机制，为研究抗炎药物H21的抗炎机制奠定了一定的理论基础，减少了研究成本和时间，也为揭示其他药物的作用机制提供了新的思路和方向.
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图 2 IRAK1受体与H21的相互作用
注：
Figure 2. The interaction of IRAK1 receptor and H21
表 1 靶蛋白与H21对接汇总
Table 1 The docking summary of target protein and H21
蛋白 对接分数 对接能量 蛋白 对接分数 对接能量 RIP -3.364 -43.325 P38γ -5.002 -52.878 IκB -4.495 -44.574 MEK1 -4.297 -43.251 TAK1 -5.810 -52.784 PKCα -6.184 -50.677 RIP2 -6.172 -47.417 RASN -3.043 -41.289 IRAK1 -9.873 -61.601 ERK2 -4.388 -41.848 IRAK4 -4.261 -44.487 ERK1 -3.216 -38.583 MK2 -5.521 -47.589 RASK -3.096 -33.033 MK3 -4.785 -45.819 KSR2 -3.716 -39.419 TYK2 -3.890 -37.062 PKCβ -3.885 -47.956 JAK2 -4.230 -52.320 CRAF -2.570 -42.002 MSK1 -5.347 -42.120 JNK3 -6.019 -49.533 P38β -3.656 -50.414 JNK1 -4.579 -47.221 MKK6 -2.712 -45.235 MKK4 -4.398 -40.509 P38α -5.341 -31.335 ASK1 -4.283 -50.710 P38ξ -3.944 -44.443 
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