The Effect of Lead (Pb) in Water on the Intestinal Structure and Function of Juvenile Grass Carp (Ctenopharyngodon idellus)
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摘要: 以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)幼鱼为研究对象，采用急性毒性实验法研究铅(Pb)对平均体质量为(6.0±1.5) g的草鱼幼鱼的急性毒性效应.获得了96 h所对应的半致死质量浓度LC50值，计算了Pb对草鱼幼鱼的安全质量浓度(SC)，并检测了安全质量浓度胁迫0、3、6、12、24、48、72、96 h后草鱼幼鱼肠道Pb的质量分数、消化道酶活力、肠道结构及炎症相关基因表达和肠道组织结构的变化.结果表明：Pb对草鱼幼鱼96 h的SC为3.46 mg/L.随着时间变化，Pb在草鱼肠道内富集；炎症相关因子IL-1β、TNF-α、IL-10的表达量均呈现显著上调后降低；胰蛋白酶和脂肪酶的活力在实验后期均出现不同程度的显著性下降; 肠道紧密连接蛋白基因Claudin-3和ZO-1的转录水平出现显著上调后下降，肠道的隐窝深度和内壁厚度先上升后逐渐恢复.本研究可为进一步开展Pb对淡水养殖鱼类的毒性机理研究奠定试验基础，为保障水产品质量和保护渔业资源提供数据支持.Abstract: The juvenile grass carps (Ctenopharyngodon idellus) with an average body mass of (6.0±1.5) g were selected to test the acute toxic effect of lead (Pb). The LC50 value of the semi-lethal concentration corresponding to 96 h was obtained and the safe concentration (SC) of Pb on grass carp juveniles was calculated. The changes of intestinal tissue structure, Pb concentration, digestive enzyme activity and the expression of inflammation and intestinal structure-related genes were detected at 0, 3, 6, 12, 24, 48, 72 and 96 h after stress. The result showed that the SC of Pb on juvenile grass carps for 96 h was 3.46 mg/L. Pb was enriched in the intestines of grass carp after challenge. The expression levels of inflammation-related genes, IL-1β, TNF-α and IL-10, were significantly up-regulated upon lead stress. The activity of trypsin and lipase showed significant down-regulation at the late stage of the experiment. The transcriptional levels of the gene of intestinal tight junction proteins, Claudin-3 and ZO-1, significantly up-regulated after lead challenge. The depth of the crypt and the thickness of the intestinal wall increased and then gradually recovered. After the enrichment of Pb in the intestine, the structural changes of the intestine are coordinated with functional changes. This study will provide a test basis for better understanding of the toxic mechanism of Pb on freshwater aquaculture, and provide data support to ensure the quality of aquatic products and protect fishery resources.
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Keywords:
- Pb /
- grass carp /
- intestine /
- safe concentration (SC) /
- inflammation /
- tight junction protein
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随着工业化的推进和科技的进步，大量不能被降解的重金属废物排放到水体中，过度的积累造成严重的水生生物健康问题[1].重金属中的Pb是强毒性元素，过量摄入会严重影响生物体的活性[2-3].目前，在我国的珠江、长江、黄河等多个水系中发现Pb严重超标，而珠江三角洲水产养殖的飞速发展，Pb污染显得尤为严峻[4]. Pb对鱼的危害是巨大的，会导致其生长和繁殖异常[5].当水体中Pb含量超标，细胞内钙稳态失调会导致细胞死亡[6].
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科草鱼属，又名鲩鱼，是全球主要的养殖鱼类之一，年均产量占全球淡水养殖鱼类产量的15.6%[7].肠道是鱼类从外界水体获取营养和能量的最重要的消化器官，维持肠道的正常稳定对鱼体的健康生长有重要的作用[8].近年来，关于草鱼的研究主要集中在代谢、疾病防治等方面，在重金属污染方面的研究较少[9-10].大部分鱼对铅的耐受性较强，常态下无法根据鱼体外观行为判断水体中铅含量是否超过《国家渔业水质标准》[11].在实际应用中，重金属严重影响鱼体的营养吸收能力，增加养殖渔业的成本，当鱼体内的重金属含量过度积累，人食用后会引起许多健康问题[12].因此，安全质量浓度下的Pb是否对鱼体内器官组织结构和免疫等功能产生危害应引起相关部门的注意[4, 11, 13].而全面地从免疫、酶活力和肠道结构等方面对草鱼进行安全质量浓度下的水体Pb毒性效应评价暂未见报道.
本文以草鱼为实验鱼种，对Pb进行毒性研究，并在此基础上，按安全质量浓度进行铅对草鱼肠道的胁迫.通过检测多个与草鱼肠道相关基因的表达水平、消化酶活力水平以及肠道结构形态变化程度，深入和全面地探究了安全质量浓度下Pb在草鱼肠道的累积程度和对肠道的毒性作用机理，不仅为今后的水生生物毒理学研究提供实验基础，还为进一步保障水产品的质量提供参考依据，对于养殖水环境质量控制和保护渔业资源等具有一定的意义[14-15].
1. 材料与方法
1.1 实验用鱼
实验用草鱼购自广州市花都区花山粤强丰水产养殖场，选取大小规格整齐、体表无伤、鱼体健壮、体质量为(6.0±1.5) g的健康草鱼300尾.鱼种从养殖场运回后，先驯养30 d使其充分适应养殖环境，30 d内个体自然死亡率极低(< 1.7%).实验在水族箱进行，每个水族箱中水体容积为30 L，养殖循环水温度为23~25 ℃，pH为7.5~7.7，ρ(NH4+-N)≤0.05 mg/L，ρ(DO)≥6.0 mg/L.
1.2 仪器与试剂
微波消解仪(屹尧，上海), 电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS), Nanodrop 2000(Thermo，USA), 7500 real-time PCR仪(Applied Biosystems，USA), 光学显微镜, Trizol试剂(Invitrogen，USA), 反转录试剂盒(Takara，日本), SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒(Takara，日本), 总蛋白、胰蛋白酶和脂肪酶试剂盒(建成，南京), 多聚甲醛, 70%酒精, 分析纯硝酸铅Pb(NO3)2, 优级纯浓硝酸HNO3.
1.3 实验方法
1.3.1 安全质量浓度的测定
用分析纯硝酸铅Pb(NO3)2配成Pb质量浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100、1 000 mg/L的实验液，其离子质量浓度常用对数呈等差数列，每组10尾鱼，观察24 h，实验进行若干次，直至确定Pb对草鱼的100%致死质量浓度最小值(44.0 mg/L)和0%致死质量浓度的最大值(21.0 mg/L)[11].
以预实验的数据设定致死质量浓度范围，按质量浓度常用对数呈等差数列，设定5个质量浓度梯度(21.0、25.0、30.0、36.0、44.0 mg/L)和一个对照组(0 mg/L)[11].每组10条鱼，分别记录96 h后每组草鱼的死亡率.根据各组的死亡率，利用直线回归法作图计算得出96 h的半致死质量浓度LC50，根据公式SC=LC50×0.1得出安全质量浓度(SC)[13].
1.3.2 Pb应激和取样
草鱼随机分成实验组和对照组，实验组用分析纯Pb(NO3)2按测定得出的安全质量浓度与养殖水直接配成实验液对草鱼进行胁迫，对照组不添加Pb(NO3)2.胁迫后0、3、6、12、24、48、72、96 h取肠道中部组织，每个时间点取3条鱼，部分用多聚甲醛常温保存用于制作肠道切片，其余在液氮速冻后-80 ℃下保存待用.
1.3.3 草鱼肠道Pb质量分数的测定
取鱼的肠道组织，匀浆均匀，放入微波消解内罐，添加4 mL优级纯浓硝酸(HNO3)消解1 h后，放入微波消解仪中.微波消解程序：120 ℃升温5 min，恒温5 min；150 ℃升温5 min，恒温10 min；190 ℃升温5 min，恒温20 min.微波消解结束后脱气2 h，用水定容至50 mL待用.将Pb标准溶液注入电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)中制作标准曲线后，将微波消解后的样品注入ICP-MS中，根据标准曲线得到消解液中肠道组织Pb的质量分数[16].
1.3.4 总RNA的提取和实时荧光定量PCR
取出鱼样的肠道组织，使用Trizol试剂提取总RNA，并用Nanodrop 2000对RNA进行质量浓度与数量的检测，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA的完整性[17].检测合格后使用反转录试剂盒对RNA立即进行反转录.将反转录后的样品以草鱼β-actin(DQ211096.1)作为内参基因[18]，按照SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒操作，在ABI 7500 real-time PCR仪上进行qRT-PCR，测定IL-1β、TNF-ɑ、IL-10、ZO-1、Claudin-3的mRNA表达水平.扩增程序:95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，循环40次.应用软件Primer Premier 5.0进行引物设计，引物委托广州擎科生物技术有限公司合成，β-actin及相关基因引物和NCBI序列号见表 1.
表 1 qRT-PCR实验所用的引物序列Table 1. Sequences of primers used in qRT-PCR引物 预测序列号 引物序列(5'→3') RT-β-actin F DQ211096.1 TGGCATCACACCTTCTACAACG RT-β-actin R GGGACAGCACAGCCTGGATG RT-IL-10 F FJ560431.2 AAAATCCCTTTGAGTTTGCCAC RT-IL-10 R TGCTTTTCTCTCTTTGATGCCA RT-Claudin-3 F KF193858.1 CAAACCAAATCACTCGGGACTT RT-Claudin-3 R GCCCATTCTCGGTGGATTG RT-TNF-α F HQ696609.1 TTGCCGAGGGTGATGGTG RT-TNF-α R ACTTGTTGAGCGTGAAGCAGAC RT-IL-1β F JN705663.2 TTCTGGTGAAAAGCAGCGGA RT-IL-1β R CAGACACACAGGCTGGGATG RT-ZO-1 F KF193852.1 CTGTCCTACTTTGACCGCCG RT-ZO-1 R CACTGACTCTGTCCTGGGGTAGTA 1.3.5 草鱼消化酶活性的测定
分别使用总蛋白、胰蛋白酶和脂肪酶试剂盒进行草鱼消化酶的测定：取出草鱼肠道组织，按1:9加入生理盐水，冰浴上机械匀浆3~5 min，制成组织匀浆液，用低温离心机在4 ℃、2 500 r/min条件下离心10 min，取上清液，按试剂盒上的说明书测定草鱼肠道组织的总蛋白含量、胰蛋白酶活性及脂肪酶活性[19].
1.3.6 肠道组织切片
将多聚甲醛保存的肠道组织固定24 h后，用70%酒精冲洗，各级乙醇脱水，按常规进行石蜡包埋，HE染色，中性胶封藏后制成肠道组织切片[20].将组织切片置于光学显微镜观察并拍照，利用Image pro plus 6.0软件统计分析小肠内壁厚度及隐窝深度.
1.4 数据统计
所有实验数据均以均值±标准差(Mean±SD)表示.数据采用SPSS 20.0软件，以One-way ANOVA及LSD法(最小显著性差异法)进行单因素方差分析及显著性检验.若P < 0.01，表示差异极显著.用Graph Pad Prism 5.0数据绘图.
2. 结果与讨论
2.1 Pb对草鱼的急性毒性
草鱼幼鱼在高质量浓度(44.0 mg/L)的重金属Pb胁迫下，观察到中毒症状明显：行为异常，平衡能力受到显著影响，随着暴露时间延长，运动速度逐渐变慢，反应越来越迟钝，最后死亡.在低质量浓度(21.0、25.0 mg/L)Pb胁迫组中也观察到了类似的症状，只是情况相对较轻.根据各质量浓度Pb的96 h状态下的死亡条数(图 1)，按直线回归法得出半致死质量浓度(LC50)为34.6 mg/L，安全质量浓度(SC)为3.5 mg/L.对比《中华人民共和国国家渔业水质标准》[11](Pb质量浓度应低于0.05 mg/L)，Pb对草鱼的安全质量浓度高于国家渔业水质标准的70倍.
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图 1 Pb质量浓度对草鱼死亡数的影响Figure 1. The effect of Pb mass concentration on the death of grass carp2.2 Pb胁迫下草鱼肠道内Pb质量分数的变化
在安全质量浓度(3.5 mg/L)的重金属Pb胁迫下，草鱼肠道内Pb的质量分数从3 h开始逐渐增加，但在3、6 h内的差异无统计学意义(P>0.05)，12、24、48、72、96 h的肠道Pb质量分数显著增加(P < 0.01)(图 2).实验结果表明：Pb在草鱼的肠道有累积，而且随着暴露时间越长，Pb的累积量越大，在实验后期的96 h肠道Pb的质量分数已经达到150 mg/kg以上，超过国内外鱼体重金属质量分数的标准限值(500 ug/kg)300倍以上，显著高于正常水质下草鱼肠道的Pb质量分数, 超标的鱼被人类食用后，会严重影响人的健康[14-15, 21].实验的中后期，肠道Pb质量分数的增加量较前期大，可能是因为草鱼肝脏组织中产生的金属硫蛋白(MT)束缚Pb，减缓了Pb在肠道中的积累，而肝脏的解毒能力有限，所以实验中后期肠道的Pb质量分数显著增加[22].
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图 2 胁迫下草鱼肠道内Pb质量分数的变化Figure 2. The changes of Pb mass fraction in the intestine of grass carp under stress2.3 Pb对草鱼肠道的炎症相关因子IL-1β、TNF-ɑ和IL-10的mRNA表达水平的影响
肠道上皮既可以吸收外源营养物质，同时也具有分隔外源进入肠道的有害物质、防止致病性抗原侵入机体的功能，起到了屏障的作用[23-24].而肠道屏障功能的损坏，与自身的免疫和炎症疾病有很大的关联[25].利用qRT-PCR检测了草鱼肠道组织内IL-1β、TNF-ɑ和IL-10在安全质量浓度Pb的胁迫下的相对表达量变化(图 3)，Pb胁迫下的IL-1β、TNF-ɑ的相对表达量均呈现了上调的趋势. IL-1β在Pb胁迫12 h后的相对表达量的差异具有统计学意义(P < 0.01)，在72 h达到最高，为对照组5倍以上，然后稍有下降, 但在实验结束时，IL-1β的相对表达量显著高于对照组. TNF-ɑ在Pb胁迫6 h的相对表达量出现差异(P < 0.05)，在12 h达到最高值，约为对照组的21倍(P < 0.01)，在实验结束时，TNF-ɑ的相对表达量显著高于对照组. IL-10在Pb胁迫下的相对表达量变化与TNF-ɑ类似，胁迫6 h后出现差异(P < 0.01)，12 h达到对照组的5.3倍后，在24 h下降到和胁迫前同一水平(P > 0.05). IL-10主要调控炎症反应，是一个重要的抗炎和免疫抑制因子，可以降低TNF-ɑ和IL-1β的表达，限制促炎症因子TNF-ɑ和IL-1β引起的不必要的组织破坏，因此其上调可能是导致炎症相关因子IL-1β和TNF-ɑ的相对表达量下调的原因[26-27].在孟晓林等[23]的研究中，重金属Cu经过对鲤鱼56 d的长期胁迫后，肠道抑炎症因子IL-10的相对表达量出现了显著性下降，促炎症因子IL-1β、TNF-ɑ的相对表达量出现了显著性上升，可能因为在实验的后期，IL-10的减少可能将导致TNF-ɑ和IL-1β的相对表达量再次升高，并最终导致炎症的发生.
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图 3 Pb胁迫下IL-1β、TNF-ɑ及IL-10在肠道中的表达变化Figure 3. The expressional dynamics of IL-1β, TNF-ɑ and IL-10 in intestines under lead stress2.4 Pb对草鱼肠道的消化酶活力表达水平的影响
消化酶是在鱼类的消化过程中起到重要的调节作用的一类蛋白，消化酶的活性变化能及时反映出鱼对环境变化的响应[28].用酶活力试剂盒测定在安全质量浓度Pb的胁迫下草鱼肠道组织的胰蛋白酶活力和脂肪酶活力的相对表达量变化(图 4). 图 4A中，Pb胁迫下的草鱼肠道的胰蛋白酶活力相对比值呈先升后降趋势，在3 h即出现差异(P < 0.05)，在24 h胰蛋白酶活力相对比值达到最高值，接近对照组的1.5倍(P < 0.01)，之后逐渐降低，48 h后胰蛋白酶活力相对比值极显著性下降(P < 0.01).于丰军[29]的研究中发现，Pb对河蟹胁迫45 d后，胰蛋白酶活力出现显著性下降，说明虽然在实验的前期胰蛋白酶受到诱导，但可以证实在长期胁迫下，安全质量浓度的重金属Pb对水体生物的胰蛋白酶有明显抑制作用. 图 4B中，草鱼肠道的脂肪酶活力相对比值在胁迫后3 h即出现极显著性下调，不足对照组的0.5倍(P < 0.01). Pb对草鱼的胰蛋白酶和脂肪酶活力的抑制，可能通过产生活性氧自由基造成DNA的断裂损伤而影响消化酶的基因表达，最终降低草鱼的消化酶活力[30].消化酶活性的降低，将导致草鱼肠道对摄入营养物质的消化吸收能力降低，降低饲料效率[31].
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图 4 Pb胁迫下肠道胰蛋白酶和脂肪酶活性的变化Figure 4. The changes of trypsin and lipase activity in intestines under lead stress2.5 Pb对草鱼肠道结构的影响
2.5.1 Pb对草鱼的紧密连接蛋白基因相对表达水平的影响
肠黏膜机械屏障的结构基础是完整的肠上皮细胞和相邻肠上皮细胞之间的连接，而紧密连接是肠上皮细胞间主要的连接方式，ZO-1和Claudin-3则是肠道的紧密连接蛋白之一[32].用qRT-PCR检测草鱼肠道组织内的紧密连接蛋白基因Claudin-3和ZO-1在安全质量浓度Pb的胁迫下的相对表达量变化(图 5). 图 5A中，在安全质量浓度Pb的胁迫下，草鱼肠道的Claudin-3相对表达量在12、24 h上调，差异具有统计学意义(P < 0.01)，在24 h达到对照组的3倍以上，之后表达水平呈下降趋势. 图 5B中，ZO-1的相对表达量在Pb胁迫后6、12、24 h上调，差异有统计学意义(P < 0.01)，在24 h的相对表达量最高，达到对照组的2倍以上，之后ZO-1的相对表达量下调. ZO-1和Claudin-3在实验前期的相对表达量迅速上调，可能是因为Pb在前期刚进入草鱼肠道后，因为紧密连接蛋白调节着机体中的离子和大分子物质的运输，阻止毒性大分子通过，从而短期内其基因的相对表达量显著上升，保护机体抵御Pb的侵入[32].
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图 5 Pb胁迫下Claudin-3和ZO-1在肠道中的表达变化Figure 5. The changes of Claudin-3 and ZO-1 expression in intestines under lead stress2.5.2 Pb对草鱼肠道绒毛隐窝及内壁厚度的影响
肠道组织切片经HE染色(图 6A)及统计学分析(图 6B)，在24 h的肠道隐窝深度增加，增加到对照组的1.2倍以上，差异有统计学意义(P < 0.05)，之后逐渐恢复；图 6C中，肠道内壁在Pb胁迫后逐渐加厚，在6 h显著高于对照组(P < 0.05)，在12 h肠道内壁的相对厚度增加到最高，为对照组肠道内壁厚度的1.3倍(P < 0.01)，之后逐渐恢复.肠道的内壁厚度、平均隐窝深度与肠道紧密连接蛋白的表达量成正相关，所以草鱼的肠道内壁厚度和平均隐窝深度也出现了先升后降的趋势[33].在96 h，肠道的ZO-1表达量下降恢复后，草鱼肠道甚至出现了黏膜糜烂的情况，形态也出现了变化.说明Pb对草鱼的影响，短期内可使草鱼的肠道出现应激从而引起肠道的保护机制，但长期的影响下，与其他重金属相似，Pb毒性随着铅的积累而增加，最终对草鱼肠道的形态结构会造成一定的破坏[34].
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图 6 Pb胁迫下肠道结构形态的变化Figure 6. The changes of morphological structure of intestines under lead stress3. 结论
以草鱼为研究对象，采用安全质量浓度下Pb胁迫的方式，对肠道的炎症基因、消化酶活力以及肠道结构形态变化进行分析，实验结果表明：
(1) Pb胁迫后，草鱼肠道促炎症因子IL-1β和TNF-α的表达水平在96 h显著高于对照组；而抑炎症因子IL-10在12 h表达水平上升至对照组5倍以上，之后显著下降. Pb胁迫草鱼的后期，Pb对肠道炎症发生有显著促进作用.
(2) Pb胁迫下，草鱼肠道的胰蛋白酶活力在前期上调，24 h后显著性下降，脂肪酶活力在Pb胁迫3 h后下降；2种消化酶的活力在后期(96 h)都显著性低于对照组的消化酶表达水平，约为对照组的1/10. Pb对草鱼肠道的消化酶活力有显著的抑制作用.
(3) Pb胁迫下，草鱼肠道的紧密连接蛋白基因ZO-1和Claudin-3的表达水平显著上升，在24 h达到对照组的2倍以上后下降.隐窝深度的相对比值在24 h明显高于对照组，后逐渐恢复，内壁厚度在6、12 h出现了显著上调后下降.
(4) Pb胁迫下，草鱼肠道Pb的质量分数随着暴露时间越长，Pb累积量越大，胁迫96 h后肠道Pb的质量分数已经累积到150 mg/kg以上.
结合以上结果得出，在Pb胁迫过程中，鱼体的表面生长及外观行为并无异常，但机体的结构功能受到了较大影响. Pb胁迫草鱼的前期, 免疫屏障对机体进行自我保护, 经过Pb的长期胁迫后, 酶活力和紧密连接蛋白基因的表达量下降, 肠道结构发生变化，可能与肠道的免疫屏障受到破坏相关, 最终导致炎症的发生. Pb对肠道的影响随着胁迫时间的延长, 毒性显著增强, 这可能与Pb在鱼体内不断累积有关.
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图 1 Pb质量浓度对草鱼死亡数的影响
Figure 1. The effect of Pb mass concentration on the death of grass carp
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图 2 胁迫下草鱼肠道内Pb质量分数的变化
Figure 2. The changes of Pb mass fraction in the intestine of grass carp under stress
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图 3 Pb胁迫下IL-1β、TNF-ɑ及IL-10在肠道中的表达变化
Figure 3. The expressional dynamics of IL-1β, TNF-ɑ and IL-10 in intestines under lead stress
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图 4 Pb胁迫下肠道胰蛋白酶和脂肪酶活性的变化
Figure 4. The changes of trypsin and lipase activity in intestines under lead stress
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图 5 Pb胁迫下Claudin-3和ZO-1在肠道中的表达变化
Figure 5. The changes of Claudin-3 and ZO-1 expression in intestines under lead stress
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图 6 Pb胁迫下肠道结构形态的变化
Figure 6. The changes of morphological structure of intestines under lead stress
表 1 qRT-PCR实验所用的引物序列
Table 1 Sequences of primers used in qRT-PCR
引物 预测序列号 引物序列(5'→3') RT-β-actin F DQ211096.1 TGGCATCACACCTTCTACAACG RT-β-actin R GGGACAGCACAGCCTGGATG RT-IL-10 F FJ560431.2 AAAATCCCTTTGAGTTTGCCAC RT-IL-10 R TGCTTTTCTCTCTTTGATGCCA RT-Claudin-3 F KF193858.1 CAAACCAAATCACTCGGGACTT RT-Claudin-3 R GCCCATTCTCGGTGGATTG RT-TNF-α F HQ696609.1 TTGCCGAGGGTGATGGTG RT-TNF-α R ACTTGTTGAGCGTGAAGCAGAC RT-IL-1β F JN705663.2 TTCTGGTGAAAAGCAGCGGA RT-IL-1β R CAGACACACAGGCTGGGATG RT-ZO-1 F KF193852.1 CTGTCCTACTTTGACCGCCG RT-ZO-1 R CACTGACTCTGTCCTGGGGTAGTA 
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