The Inhibition of Pathogenic Vibrios with Lactobacillus Paracasei S-4
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摘要: 针对弧菌病害的防治，选取了一株副干酪乳酸菌(Lactobacillus paracasei)S-4对4种致病弧菌进行体外拮抗实验，并在此基础上比较了不同发酵时长及稀释倍数的上清液对弧菌的抑制作用，同时探究了抑菌物质特性及进行共培养拮抗实验.结果显示：副干酪乳酸菌S-4对4株致病弧菌均具有显著的抑制作用.副干酪乳酸菌S-4生长过程中，0~16 h的上清液无抑菌活性，20 h后开始表现出对4株弧菌的抑制作用；36 h时的上清液对创伤弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌的抑制率大于95.42%，且该上清液3倍稀释后的抑菌活性无显著降低，为最佳收获时间；72 h时的上清液对溶藻弧菌的抑制率达到95.72%，6倍稀释后的抑菌活性无显著降低，为抑制溶藻弧菌的最佳收获时间.进一步探究菌株间的相互拮抗表明：副干酪乳酸菌S-4在共培养4~6 h就表现出明显的抑菌活性，比上清液提前12 h产生抑制效果，在培养初期就能有效抑制弧菌的生长.生化分析表明：抑菌物质对过氧化氢酶、蜗牛酶、胃蛋白酶不敏感，与多肽类物质无关，酸碱中和后抑菌活性完全消失，推测为有机酸.本研究表明：副干酪乳酸菌S-4对4株常见致病弧菌具有较强抑制作用，在水产养殖中具有潜在应用价值.Abstract: A strain of lactic acid bacteria S-4, identified as Lactobacillus paracasei S-4 according to the nucleotide sequence of its 16S rDNA, was used to conduct experiments to observe its antagonistic effect on four strains of vibrio. This study compared the antibacterial effect of supernatant with different culture durations and dilution ratios on vibrio and explored the competition of L. paracasei S-4 in co-cultivation with vibrio in vitro. The results showed that the supernatant had no inhibitory activity at 16 h of fermentation but showed inhibitory activity to 4 strains of vibrio after 20 h culture. And 36 h supernatant was the best harvest time for inhibiting V. harveyi, V. vulnificus and V. parahaemolyticus, when the inhibition percentage reached more than 95.42% and there was no significant decrease of inhibitory effect after 3-fold dilution. But to V. alginolyticus, 72 h supernatant was the best harvest time and showed a 95.72% inhibition ratio, and 6-fold dilution of it exhibited no significant difference. L. paracasei S-4 in co-cultivation with vibrio started to reduce the 4 strains of vibrio at 4-6 h, its inhibitory activity appearing 12 h ahead of supernatant, indicating that L. paracasei S-4 was able to inhibit the growth of vibrio at the beginning of culture. Biochemical assay showed that the inhibitory compounds were insensitive to catalase, pepsase and snailase, and ultrafiltration and cold ethanol precipitation could not eliminate their inhibitory activity. But the inhibitory activity disappeared completely when supernatant pH was adjusted to neutral, indicating that organic acid may play an important role in bacteriostatic activity. The results of this study showed that L. paracasei can strongly inhibit 4 strains of vibrio and has potential value of application in aquaculture.
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Keywords:
- Lactobacillus paracasei /
- vibrio /
- inhibitory activity /
- co-culture /
- aquaculture
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我国作为对虾养殖大国，在2014年养殖产量就已经达到120万t，约占世界总产量的40%.弧菌作为海水养殖中普遍存在的致病菌，严重威胁对虾的品质和存活率，常见的致病弧菌包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌等近10种[1-2].致病弧菌主要通过其有活性的胞外产物如蛋白酶、溶血素等作用于对虾，受其感染的对虾会出现发育迟缓、昏睡、活动力下降、厌食、体表泛红等其他症状[3-4].早些年，抗生素作为抑制弧菌的常用方法，虽然能在一定程度上有效抑制弧菌的繁殖，但同时也引发食品安全问题及生态环境问题[5].
益生菌的应用日渐成为控制弧菌病害的主要手段，其中乳酸菌[6-7]、芽孢杆菌[8-9]、酵母菌[10-11]等益生菌的使用已有相关报道.乳酸菌作为益生菌中重要的一类，大量研究表明其能在水生动物肠道内占据生态位，通过分泌有机酸、过氧化氢、细菌素等抑菌物质，有效抑制致病菌的繁殖，提高水生动物免疫力和抗病性[12-15]，同时能产生胞外多糖[16]，提高消化道酶活性[17]，有效促进对虾生长.目前关于乳酸菌在对虾养殖中的研究报道多为植物乳酸菌，有关干酪乳酸菌和副干酪乳酸菌的研究较少.副干酪乳杆菌作为乳杆菌菌群的重要一员，具有较强的抑菌效果，在肠道调节和免疫力等方面具有良好的促进作用[18]，在对虾养殖中的应用前景明朗.
本研究选取1株对4株致病弧菌具有抑制作用的副干酪乳酸菌S-4，比较其上清液在不同发酵时长及稀释倍数下对致病弧菌的抑制活性变化，在此基础上进行共培养实验探究菌株间相互拮抗作用，并对抑菌物质进行理化分析，旨在为副干酪乳酸菌作为饲料添加剂的研究和应用提供有益的参考.
1. 材料与方法
1.1 实验菌
副干酪乳酸菌S-4(L. paracasei, MH497582，简称乳酸菌S-4)为本实验室保藏，分离自江门大鳌镇虾池表层泥样.
哈维氏弧菌(Vibrio. harveyi, MH536240)、创伤弧菌(Vibrio. vulnificus, MH536213)、副溶血弧菌(Vibrio. parahaemolyticus, MH536241)由中国水产科学研究院南海水产研究所冯娟博士提供，溶藻弧菌(Vibrio. alginolyticus, MH536239)为本实验室所保存.
1.2 培养基
改良MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g，酵母粉10.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水1 000 mL，115 ℃灭菌30 min. 2216E培养基：蛋白胨5.0 g，酵母粉1.0 g，磷酸铁0.01 g，10‰人工海水1 000 mL，115 ℃灭菌30 min. TCBS培养基：购自英国Oxoid公司.
1.3 乳酸菌S-4的拮抗弧菌初步试验
根据WANG等[19]采用牛津杯琼脂扩散法测定乳酸菌抑菌活性.在2216E琼脂平板培养基上均匀涂布100 μL新培养的弧菌菌液(OD600=1.0)，静置10 min吸收菌液，每个琼脂平板培养基上轻放3个已灭菌的牛津杯，设置成3个平行，往牛津杯内加入200 μL在37 ℃下200 r/min摇瓶培养28 h后经4 000 r/min离心获取的乳酸菌S-4的发酵上清液，在37 ℃培养箱中培养12 h，测量抑菌圈直径，通过计算抑菌圈面积确定乳酸菌S-4的抑菌活性.
1.4 菌株生长、发酵时长及稀释倍数对上清液抑菌活性的影响
1.4.1 乳酸菌S-4的生长与上清液抑菌活性的变化
乳酸菌S-4的菌液(OD600=2.0)按1%接种量接种于MRS液体培养基，37 ℃、200 r/min摇瓶培养36 h.期间每隔4 h取样，一部分样品用紫外可见光分光度计(METASH, China)在波长为600 nm下测定菌液吸光值；另一部分经0.22 μm微孔滤膜过滤，收集上清液，在无菌环境下用pH计(OHAUS, China)测定酸碱度后采用牛津杯琼脂扩散法测定其抑菌活性.
1.4.2 发酵时长、稀释倍数对上清液抑菌活性的影响
乳酸菌S-4(OD600=2.0)按1%接种量接种于MRS液体培养基中，37 ℃、200 r/min摇瓶培养24、36、48、60、72 h.各时长发酵液经微孔滤膜过滤收集上清液，并用MRS液体培养基对上清液进行0、3、6、9和12倍稀释.然后按1%接种量接种发酵24 h的弧菌悬浮液(浓度为1×109 CFU/mL)至稀释处理的发酵上清液，在37 ℃、200 r/min摇瓶培养12 h，另接种等量弧菌于等量MRS液体培养基中作为对照.培养12 h后测定菌液吸光值(OD600)，按照公式：抑制率(%)=[1-(试验组吸光值-空白对照组吸光值)/(对照组吸光值-空白对照组吸光值)]×100%[20]，计算抑制率.实验进行3次重复.
1.5 抑菌物质的理化性质分析
收集在37 ℃、200 r/min摇瓶培养36 h的乳酸菌上清液，在无菌条件下，进行如下处理：
(1) 酸碱处理：通过0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl调节上清液至pH=7.00.
(2) 酶处理：用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L HCl溶液调节上清液至酶的最适pH，按1 g/L的量加入胃蛋白酶、过氧化氢酶、蜗牛酶，在37 ℃水浴锅中水浴1 h，水浴结束后温度调节至65 ℃，水浴10 min对酶制剂灭活处理，最后将pH调节至原始值.
(3) 蛋白质沉淀处理：根据SEQUEIROS等[21]的方法，利用冷乙醇法沉淀蛋白质及多肽，同时进行双缩脲试剂反应以确保蛋白质或多肽充分去除.
(4) 超滤处理：利用30、10、3 kDa孔径超滤管(Merck Millipore, China)，依据说明书操作对样品进行超滤.
以上处理后的样品均采用牛津杯琼脂扩散法测定其抑菌活性.
1.6 乳酸菌S-4与弧菌的共培养试验
乳酸菌S-4和弧菌按1:5接种于MRS液体培养基中，乳酸菌初始浓度为2×106 CFU/mL，弧菌初始浓度为1×107 CFU/mL，对照组只接种等量弧菌.接种后在37 ℃、200 r/min条件下培养10 h.分别在0、2、4、6、8、10 h收集样品，利用TCBS培养基对弧菌的选择性[22]，按1%接种量将样品接种于TCBS液体培养基中，在37 ℃、200 r/min条件下培养至各弧菌生长对数生长期(创伤弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌为4 h，溶藻弧菌为3.5 h)，收集样品，4 000 r/min，10 min离心，弃上清液，加入生理盐水震荡摇匀，重复清洗3次，最后加入等量生理盐水测定菌液的吸光值，绘制弧菌的相对生长曲线.
1.7 数据分析处理
数据采用SPSS 18.0进行单因素方差分析，以P < 0.05作显著水平判定，用Origin 2018进行数据绘图.
2. 结果与分析
2.1 乳酸菌S-4的体外拮抗弧菌实验
牛津杯琼脂扩散法测试结果如表 1所示，乳酸菌S-4的28 h发酵上清液能有效抑制4种致病弧菌的生长繁殖，且对不同种类的弧菌抑菌效果存在差异，其中对溶藻弧菌的抑制作用最强.
表 1 发酵28 h的上清液对4株弧菌的抑菌圈面积Table 1. The inhibition zone area of 28 h fermentation supernatant to four strains of vibrio菌株 抑菌圈面积/mm2 溶藻弧菌 163.79±8.90a 副溶血弧菌 115.39±5.97d 创伤弧菌 114.85±1.31b 哈维氏弧菌 117.07±6.14bc 注：不同小写字母表示差异具有统计学意义(P < 0.05)，表 2同. 表 2 发酵上清液经酶处理、超滤管超滤、pH调节后对抑菌活性的影响Table 2. The effect of enzyme treatment, ultrafiltration, pH change on bacteriostatic activity of fermentation supernatant处理 溶藻弧菌 创伤弧菌 哈维氏弧菌 副溶血弧菌 对照组 处理组 对照组 处理组 对照组 处理组 对照组 处理组 酶处理 胃蛋白酶 218.44±3.98a 220.82±0.71a 183.63±8.49a 185.87±3.94a 175.32±1.39a 176.90±2.28a 196.91±4.98a 195.92±5.50a 蜗牛酶 218.44±3.98a 218.79±1.92a 183.63±8.49a 183.61±0.66a 175.32±1.39a 174.93±2.51a 196.91±4.98a 193.69±1.52a 过氧化氢酶 218.44±3.98a 219.65±3.56a 183.63±8.49a 181.32±2.73a 175.32±1.39a 176.88±2.15a 196.91±4.98a 195.79±4.05a 超滤处理 30 kDa超滤 218.44±3.98a 219.37±0.55a 183.63±8.49a 182.64±1.70a 175.32±1.39a 173.34±2.28a 196.91±4.98a 200.45±3.32a 10 kDa超滤 218.44±3.98a 217.70±0.32a 183.63±8.49a 187.04±2.72a 175.32±1.39a 176.88±2.71a 196.91±4.98a 196.03±0.60a 3 kDa超滤 218.44±3.98a 217.58±3.04a 183.63±8.49a 186.24±2.24a 175.32±1.39a 175.32±2.11a 196.91±4.98a 197.41±2.08a 酸碱处理 0.1 mol/L NaOH 218.44±3.98a 0b 183.63±8.49a 0b 175.32±1.39a 0b 196.91±4.98a 0b 2.2 乳酸菌S-4的生长曲线与上清液抑菌活性分析
乳酸菌S-4连续培养36 h，期间每隔4 h测定1次菌液吸光值(OD600)、pH与抑菌活性(图 1).在经历4 h的延滞期后，菌株在8~16 h快速增长进入对数生长期，16 h后进入平台期(图 1A).上清液pH在0~28 h保持一定的下降速率逐渐降低，28 h后趋于稳定，最终维持在3.40左右.
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图 1 乳酸菌S-4的36 h生长曲线、pH变化及对4株菌的抑菌圈面积变化Figure 1. The growth curve, change of pH and inhibition zone area of L. paracasei S-4 in 36 h在菌株生长过程中，0~12 h的上清液对4株致病弧菌不具有抑菌活性(图 1B)，16 h时初步表现出对副溶血弧菌的抑制作用，此时菌液吸光值(OD600)为2.27，pH为4.70；在20 h时表现出对另外3株弧菌的抑制作用，此时菌液吸光值(OD600)上升至2.33，pH降低至4.46.在20 h后抑菌活性持续增强，菌液吸光值维持在2.40左右，但pH仍持续下降.上述结果表明上清液抑菌活性与菌液浓度相关，出现在菌液吸光值大于2.33后(已进入平台期)，且与酸碱度密切相关，在产生抑菌活性后，抑菌活性随着pH的降低持续增强.此结果与CHARERNJIRATRAGUL等[14]的研究结果相似.
2.3 发酵时长、稀释梯度对上清液抑菌活性的影响
获取24、36、48、60、72 h的乳酸菌S-4上清液，分别用MRS液体培养基进行0、3、6、9、12倍稀释，其稀释液对4株致病弧菌的抑制率如图 2~图 5所示.研究结果显示：上清液对创伤弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌的抑制作用具有相似性，具体表现为发酵24 h未经稀释的上清液对这3株弧菌的抑菌率为63.37%~75.39%，发酵时长达到36 h后，抑菌率显著提高到95.42%以上(P < 0.05)，达到最大抑菌率，后续发酵时长(48~72 h)的抑菌率无显著提升，介于93.15%~97.64%之间.同时，36、48、60、72 h的上清液稀释3倍后，对这3株弧菌的抑菌活性无显著降低(P < 0.05)，稀释6倍后则显著降低至1.62%~25.14%.
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图 2 乳酸菌S-4的梯度稀释发酵上清液对哈维氏弧菌的抑制率注：图标上方不同字母表示同一发酵时间不同稀释倍数存在显著差异(P < 0.05)，并且随着字母数值依此下降，下图同.Figure 2. The inhibition of V. harveyi by the gradient diluted fermentation supernatant of L. paracasei S-4 cultured![]()
图 3 乳酸菌S-4的梯度稀释上清液对创伤弧菌的抑制率Figure 3. The inhibition of V. vulnificus by the gradient diluted supernatant of L. paracasei S-4 cultured![]()
图 4 乳酸菌S-4梯度稀释上清液对副溶血弧菌的抑制率Figure 4. The inhibition of V. parahaemolyticus by the gradient diluted supernatant of L. paracasei S-4 cultured![]()
图 5 乳酸菌S-4梯度稀释上清液对溶藻弧菌的抑制率Figure 5. The inhibition of V. alginolyticus by the gradient diluted supernatant of L. paracasei S-4 cultured上清液对溶藻弧菌的抑制特性如图 5所示，未经稀释的上清液抑菌活性在5个发酵时长中呈现逐渐递增的趋势，抑制率分别为65.38%、83.29%、88.47%、91.52%、95.72%，其中60 h发酵液稀释3倍后抑菌活性无显著降低(P < 0.05)，72 h发酵液稀释3倍和6倍后仍无显著降低(P < 0.05).
由此可见，上清液对不同种类弧菌的抑制作用不同，发酵36 h为抑制创伤弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌的最佳收获时间，可进行3倍稀释，发酵72 h为抑制溶藻弧菌的最佳收获时间，可进行6倍稀释.
2.4 乳酸菌S-4与弧菌共培养
乳酸菌S-4分别和4株致病弧菌按1:5接种于MRS液体培养基中进行共培养(图 6).乳酸菌S-4对创伤弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌抑制作用具有相似性，在共培养6 h后，表现出对创伤弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌的抑制作用，并在后续竞争中持续抑制致病弧菌的繁殖；而对溶藻弧菌的抑制作用则在4 h时产生.结合本文结果2.2进行分析，共培养抑菌活性比单独发酵的上清液最早提前12 h表现，能在菌株共培养初期有效抑制弧菌的生长繁殖，推测可能是由于弧菌及其代谢产物对乳酸菌具有刺激或诱导作用，使其抑菌活性得以表达[23].
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图 6 弧菌与乳酸菌S-4混合培养及单独培养的生长曲线Figure 6. The growth curves of 4 strains of vibrio in co-culture system and alone2.5 抑菌物质的特性
经过胃蛋白酶、蜗牛酶及过氧化氢酶处理后，乳酸菌S-4发酵上清液的抑菌活性与原液相比差异无统计学意义(表 2)，表明抑菌物质对这3种酶不敏感，排除蛋白类抑菌物质、多糖及过氧化氢.采用冷乙醇沉淀及3种规格的超滤管(30、10、3 kDa)逐级超滤处理并进行双缩脲试剂测试(无紫色反应)，其抑菌活性与原液的差异无统计学意义，排除多肽类抑菌物质.加入0.1 mol/L NaOH后，抑菌活性完全消失，由此推测抑菌物质为有机酸.
3. 讨论
长期以来，对虾养殖一直受困于弧菌的危害，其中溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌等的一些强毒菌株危害尤甚[1]，鉴于长期使用抗生素对海水养殖中弧菌的控制导致了致病菌的耐药性增强[24]，筛选和研究乳酸菌等有益菌作为致病弧菌的拮抗菌，具有十分重要的实际应用价值.目前已有不少种类的乳酸菌被运用于水产养殖弧菌病害的防治，但关于副干酪乳酸菌的相关研究较少，本文对1株副干酪乳酸菌S-4及其上清液的抑菌特性进行初步探究.
乳酸菌发酵上清液的抑菌活性受多种因素影响，其中有研究表明菌株生长与抑菌活性密切相关，如周海平等[25]的研究表明：乳酸杆菌在培养0~12 h没有抑菌活性，24~96 h发酵上清液有显著抑菌活性，且随着培养时间延长抑菌活性增强；王伟等[26]研究显示：乳酸片球菌在发酵24 h后抑菌效果显著增强，40 h后达到最大值.本实验结果显示：副干酪乳酸菌S-4发酵上清液在0~16 h无抑菌活性，发酵至20 h后初步表现出对4株弧菌的抑制作用，且随着发酵时间的延长，抑菌活性持续增加，在36 h时达到对创伤弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌的最大抑制率(>95.42%)，而达到对溶藻弧菌的最大抑制率则需要72 h(>95.72%).表明副干酪乳酸菌S-4在发酵过程中抑菌物质不断积累，抑菌活性持续增强，且对不同种类致病弧菌的抑制效果不同，在36 h和72 h分别达到对不同种类弧菌抑制率的最大值.
上清液抑菌活性不仅与菌株生长相关，而且还与抑菌物质浓度有关. KHOUADJA等[12]研究表明37 ℃下发酵24 h的德氏乳杆菌(L. delbrueckii)、干酪乳杆菌(L. casei)、格氏乳杆菌(L. gasseri)上清液分别稀释10、5、4倍后对副溶血弧菌的抑菌活性消失.周海平等[25]研究结果表明：发酵24 h的乳酸杆菌LH上清液稀释大于8倍后对病原弧菌没有抑菌活性.本试验结果表明：发酵36 h的上清液稀释3倍后抑菌活性与原液无显著差异，仍有效抑制创伤弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌，但稀释6倍后抑菌活性显著降低至10.17%~15.13%；72 h的发酵上清液稀释6倍后对溶藻弧菌仍具有显著抑制活性，稀释9倍后抑菌活性显著降低至48.8%.说明上清液中抑菌物质的浓度在36 h时达到抑制创伤弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌的最佳抑制效果，同时稀释3倍后，仍能有效抑制，而72 h为抑制溶藻弧菌的最佳抑菌浓度，且稀释6倍仍具有显著的抑制效果.
乳酸菌作为肠道益生菌，其抑菌活性还表现在菌株间的相互拮抗作用.关于乳酸菌与致病菌的拮抗实验，KONGGNUM等[27]研究表明:植物乳杆菌MRO3.12与哈维氏弧菌按照1:1共培养，18 h后则表现出对弧菌的强抑制作用，24 h时能完全抑制弧菌生长；SHA等[28]研究结果显示按照等比例混合培养后，戊糖乳杆菌5 h则表现出对副溶血弧菌的显著抑制作用.本实验采用乳酸菌S-4与弧菌比为1:5的接种量进行共培养试验，结果表明乳酸菌S-4在4 h时则表现出对溶藻弧菌的抑制活性，而对另外3株弧菌则在6 h时产生抑菌作用，且随着培养时间延长，抑制作用逐渐增强.说明乳酸菌S-4对溶藻弧菌的胁迫更为敏感，且与单独发酵相比，共培养提前12 h表现出抑菌活性，能在共培养初期有效抑制致病弧菌的生长繁殖.
乳酸菌的抑菌活性与抑菌物质的分泌息息相关，有研究表明抑菌物质可能是过氧化氢[27]、有机酸[29]、细菌素[30]、乳酸链球菌素[31]等.本实验生化分析结果表明，乳酸菌S-4分泌的抑菌物质对胃蛋白酶、过氧化氢酶、蜗牛酶不敏感，排除蛋白质类抑菌物质、过氧化氢、多糖；超滤处理及冷乙醇沉淀除去多肽后，抑菌活性不受影响，说明与多肽类物质相关性较少；酸碱中和后，抑菌活性完全消失，推测其为有机酸.
4. 结论
(1) 副干酪乳酸菌S-4及其发酵上清液能显著抑制4种常见致病弧菌的生长.对不同种类的弧菌抑制效果不同，其中抑制哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌的最佳收获时间为36 h，3倍稀释仍能有效抑制这3种弧菌的生长，抑制溶藻弧菌的最佳发酵时间为72 h，可6倍稀释.
(2) 在共培养环境下副干酪乳酸菌S-4能在4~6 h产生抑菌活性，有效抑制弧菌感染初期的生长繁殖；抑菌物质推测为有机酸.
本试验为副干酪乳酸菌S-4在水产养殖拮抗弧菌中的应用提供了有意义的参考.
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图 1 乳酸菌S-4的36 h生长曲线、pH变化及对4株菌的抑菌圈面积变化
Figure 1. The growth curve, change of pH and inhibition zone area of L. paracasei S-4 in 36 h
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图 2 乳酸菌S-4的梯度稀释发酵上清液对哈维氏弧菌的抑制率
注：图标上方不同字母表示同一发酵时间不同稀释倍数存在显著差异(P < 0.05)，并且随着字母数值依此下降，下图同.
Figure 2. The inhibition of V. harveyi by the gradient diluted fermentation supernatant of L. paracasei S-4 cultured
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图 3 乳酸菌S-4的梯度稀释上清液对创伤弧菌的抑制率
Figure 3. The inhibition of V. vulnificus by the gradient diluted supernatant of L. paracasei S-4 cultured
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图 4 乳酸菌S-4梯度稀释上清液对副溶血弧菌的抑制率
Figure 4. The inhibition of V. parahaemolyticus by the gradient diluted supernatant of L. paracasei S-4 cultured
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图 5 乳酸菌S-4梯度稀释上清液对溶藻弧菌的抑制率
Figure 5. The inhibition of V. alginolyticus by the gradient diluted supernatant of L. paracasei S-4 cultured
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图 6 弧菌与乳酸菌S-4混合培养及单独培养的生长曲线
Figure 6. The growth curves of 4 strains of vibrio in co-culture system and alone
表 1 发酵28 h的上清液对4株弧菌的抑菌圈面积
Table 1 The inhibition zone area of 28 h fermentation supernatant to four strains of vibrio
菌株 抑菌圈面积/mm2 溶藻弧菌 163.79±8.90a 副溶血弧菌 115.39±5.97d 创伤弧菌 114.85±1.31b 哈维氏弧菌 117.07±6.14bc 注：不同小写字母表示差异具有统计学意义(P < 0.05)，表 2同. 
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表 2 发酵上清液经酶处理、超滤管超滤、pH调节后对抑菌活性的影响
Table 2 The effect of enzyme treatment, ultrafiltration, pH change on bacteriostatic activity of fermentation supernatant
处理 溶藻弧菌 创伤弧菌 哈维氏弧菌 副溶血弧菌 对照组 处理组 对照组 处理组 对照组 处理组 对照组 处理组 酶处理 胃蛋白酶 218.44±3.98a 220.82±0.71a 183.63±8.49a 185.87±3.94a 175.32±1.39a 176.90±2.28a 196.91±4.98a 195.92±5.50a 蜗牛酶 218.44±3.98a 218.79±1.92a 183.63±8.49a 183.61±0.66a 175.32±1.39a 174.93±2.51a 196.91±4.98a 193.69±1.52a 过氧化氢酶 218.44±3.98a 219.65±3.56a 183.63±8.49a 181.32±2.73a 175.32±1.39a 176.88±2.15a 196.91±4.98a 195.79±4.05a 超滤处理 30 kDa超滤 218.44±3.98a 219.37±0.55a 183.63±8.49a 182.64±1.70a 175.32±1.39a 173.34±2.28a 196.91±4.98a 200.45±3.32a 10 kDa超滤 218.44±3.98a 217.70±0.32a 183.63±8.49a 187.04±2.72a 175.32±1.39a 176.88±2.71a 196.91±4.98a 196.03±0.60a 3 kDa超滤 218.44±3.98a 217.58±3.04a 183.63±8.49a 186.24±2.24a 175.32±1.39a 175.32±2.11a 196.91±4.98a 197.41±2.08a 酸碱处理 0.1 mol/L NaOH 218.44±3.98a 0b 183.63±8.49a 0b 175.32±1.39a 0b 196.91±4.98a 0b
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